發(fā)布時間：2017-10-02 19:11

  本文關鍵詞：臍帶基質干細胞的分離、鑒定及其向生殖細胞分化的研究

  更多相關文章： 人臍帶基質干細胞 小鼠原始生殖細胞 細胞共培養(yǎng) 分化

【摘要】：研究背景與目的傳統(tǒng)理論均認為人卵母細胞是不可再生細胞,免疫、環(huán)境、遺傳等多種因素及婦科腫瘤的疾病進展、治療過程均可損害卵母細胞、導致卵巢功能明顯降低,甚至衰竭,喪失生育功能,在神經、骨骼、內分泌等多方面影響女性的身心健康~[1-3]。這一類患者即使通過輔助生殖技術也無法獲得有功能的卵子。因此,獲得再生卵母細胞,是真正有助于解決這類患者無法生育及恢復其生殖-內分泌功能的重要途徑~[4]。近年來,國內外研究發(fā)現(xiàn),干細胞具備發(fā)育全能性,在一定條件下于體內或體外均可誘導分化為功能細胞~[5-7]。有關胚胎干細胞的研究發(fā)現(xiàn):胚胎原始生殖細胞經體外培養(yǎng)及體內移植可產生有功能的卵母細胞和精子,并成功生育子代~[8]。但胚胎干細胞無法做到自體移植,取材不便、有致瘤性等諸多問題使其研究受到限制~[9]。因此,人們將研究重點轉向成體干細胞。其中臍帶基質干細胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs),來源于新生兒臍帶,不需要任何侵入性的過程就可以在廢棄的臍帶當中獲取它,不存在倫理學爭議等優(yōu)勢,均使其成為再生卵母細胞的重要種子來源~[10]。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn),該細胞具有分化為卵母樣細胞的潛能,可表達原始生殖細胞標記物,且能在卵巢局部存活并生長。但均尚未獲得功能性配子~[11]。究其原因,與體外使用卵巢卵泡液等誘導方式尚無法完全模擬體內微環(huán)境有關。研究顯示性腺來源的體細胞更有助于生殖細胞分化~[12],且同步化的卵巢體細胞才能促進原始生殖細胞(Primordial germ cell,PGCs)進一步減數(shù)分裂~[13]。由此我們認為減數(shù)分裂前期的胚胎卵巢與干細胞進行共培養(yǎng),有望更好地模擬體內卵巢卵子發(fā)生的微環(huán)境,同時充分利用卵巢細胞分泌細胞因子等微環(huán)境對干細胞進行環(huán)境誘導,可能更有助于觀察卵巢微環(huán)境在卵子發(fā)生中的作用,探索成體干細胞向生殖細胞分化的可能機制。因此我們擬對UCMSCs進行分離培養(yǎng)及鑒定,再與原始生殖細胞共培養(yǎng),誘導UCMSCs向卵母細胞樣細胞進行分化,探索其體外誘導生殖細胞的可能機制,為完全卵母細胞再生的研究提供思路。1實驗方法1.1 UCMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定采用機械分離方法提取新生兒臍帶膠質、進行剪碎后行組織塊直接貼壁培養(yǎng)UCMSCs,運用流式細胞學技術檢測UCMSCs的免疫表型,進行干細胞鑒定,將P3代UCMSCs作為種子細胞。1.2 PGCs的分離培養(yǎng)及鑒定采用機械分離12.5dpc(days posteoltum,發(fā)現(xiàn)陰栓的當天記為0.5dpc)的Balb/c小鼠的胎鼠生殖嵴,剪碎后行組織塊直接貼壁培養(yǎng)PGCs,運用AP染色初步鑒定細胞、運用流式細胞學技術檢測P3代PGCs的免疫表型,進一步進行細胞鑒定。1.3 PGCs的生物學特性研究取P3代PGCs,細胞免疫熒光染色,逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)等技術進行PGCs的生物學特性研究。1.4誘導UCMSCs向原始生殖細胞樣細胞(Primordial germ cell-like cells,PGCLCs)分化及鑒定取P3代UCMSCs,實驗組使用PGCLCs誘導培養(yǎng)液培養(yǎng),對照組繼續(xù)使用UCMSCs培養(yǎng)液,采取置于37℃,5%CO_2及飽和濕度下培養(yǎng),隔日換液,并觀察培養(yǎng)液有無渾濁。及倒置顯微鏡下對照兩組細胞形態(tài)變化。運用流式細胞學技術檢測誘導分化后UCMSCs的免疫表型鑒定。1.5共培養(yǎng)誘導分化UCMSCs取PGCLCs+P0代PGCs為實驗組1,P4代UCMSCs+P0代PGCs為實驗組2,P4代UCMSCs+P4代UCMSCs為對照組,均利用0.4μm孔徑的Transwell小室共培養(yǎng),置于37℃,5%CO_2及飽和濕度下培養(yǎng),隔日換液,并觀察培養(yǎng)液有無渾濁。1.6 Western blot檢測UCMSCs向卵母細胞分化情況取共培養(yǎng)14d后的UCMSCs進行Western blot檢測SCP3表達情況,評估其向卵母細胞的分化情況。1.7統(tǒng)計學分析統(tǒng)計學分析應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件,計量資料以(?)表示,組間比較采用單因素x~2檢驗,P0.05為差異。2實驗結果2.1 UCMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定倒置顯微鏡下觀察組織塊貼壁培養(yǎng)3-5天后開始有少量長梭形細胞爬出,培養(yǎng)7d后細胞融合達90%,呈漩渦狀或者平行排列貼壁生長,雜細胞較少,傳代后細胞較均一,形態(tài)規(guī)則,呈長梭形,增殖快,常于傳代后2d再次接近融合狀態(tài)。流式細胞學技術檢測UCMSCs表達中胚層來源分子CD73及分子CD29,陽性率分別為62.9%、95.5%,表達內皮細胞特征分子CD31,陽性率為0.221%,表達造血干細胞系特征分子CD45,陽性率為0.186%,表達階段特異性胚胎抗原SSEA-1,陽性率為0.946%,符合UCMSCs的特征。2.2 PGCs的分離培養(yǎng)及鑒定倒置顯微鏡下觀察生殖嵴組織塊3-5天開始爬出貼壁細胞,5-7天細胞能生長至70%~80%融合,細胞輪廓清楚,排列緊密,大部分細胞形態(tài)為核質比較大的圓形或者橢圓形細胞。至80%左右融合狀態(tài)時進行傳代,傳代后細胞增殖迅速,常于傳代后3天再次接近融合狀態(tài)。AP染色細胞持續(xù)陽性,表明為含有堿性磷酸酶活性陽性的胚胎原始生殖細胞。流式細胞學技術檢測PGCs表達階段特異性胚胎抗原SSEA-1,陽性率為92.5%,表達階段特異性胚胎抗原SSEA-4,陽性率為0.71%,符合小鼠PGCs的特征。2.3 PGCs的生物學特性研究通過細胞免疫熒光染色及RT-PCR檢測可發(fā)現(xiàn),Oct4、Stra8、Vasa、Scp3、Zp3均為陽性表達,表明我們所培養(yǎng)的PGCs是一種來自小鼠胚胎早期的胚胎生殖細胞,處于未分化狀態(tài),而且在體外培養(yǎng)過程中可進入減數(shù)分裂I期。2.4誘導UCMSCs向PGCLCs分化及鑒定倒置顯微鏡下觀察實驗組:經過向PGCLCs誘導7d-9d后,開始出現(xiàn)部分核質比大的圓形或橢圓形細胞,對照組細胞仍然保持長梭形形態(tài)。貼壁培養(yǎng)14d后,實驗組細胞穩(wěn)定表達階段特異性胚胎抗原SSEA-1,陽性率為73.83%,且表達階段特異性胚胎抗原SSEA-3,陽性率為66.66%,對照組細胞表達階段特異性胚胎抗原SSEA-1及SSEA-3,陽性率分別為0.69%、0.45%,證明實驗組細胞已部分向PGCLCs分化。2.5 Western blot檢測UCMSCs向卵母細胞分化情況結果顯示,共培養(yǎng)14d后,實驗組1的SCP3蛋白表達水平為0.566622±0.008407,實驗組2的SCP3蛋白表達水平為0.271562±0.041784,對照組的SCP3蛋白表達水平為0.130108±0.022316,三組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),其中任意兩組分別對比也均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3結論1.分離培養(yǎng)了純度較高的UCMSCs;2.分離培養(yǎng)了純度較高的PGCs;3.PGCs于體外可進行持續(xù)培養(yǎng),體外培養(yǎng)過程中可進入減數(shù)分裂I期;4.UCMSCs于體外可誘導分化為PGCLCs;5.共培養(yǎng)可體外誘導UCMSCs向卵母細胞方向進行分化。
【關鍵詞】：人臍帶基質干細胞 小鼠原始生殖細胞 細胞共培養(yǎng) 分化
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R321
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 臍帶基質干細胞的分離與鑒定14-20
• 2.1 實驗材料與方法14-16
• 2.2 實驗結果16-18
• 2.3 討論18-19
• 2.4 小結19-20
• 第三章 原始生殖細胞的分離及其生物學特性研究20-31
• 3.1 實驗材料與方法20-26
• 3.2 實驗結果26-29
• 3.3 討論29-30
• 3.4 小結30-31
• 第四章 臍帶基質干細胞向生殖細胞分化的研究31-43
• 4.1 實驗材料與方法31-38
• 4.2 實驗結果38-41
• 4.3 討論41-42
• 4.4 小結42-43
• 全文總結43-44
• 參考文獻44-50
• 文獻綜述 干細胞向生殖細胞分化的研究進展50-58
• 參考文獻55-58
• 碩士期間發(fā)表文章58-59
• 致謝59

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙進峰;李星;賈紹玉;柳洪志;;人乳牙牙髓基質干細胞的研究進展[J];黑龍江醫(yī)藥科學;2009年02期

2 劉波;朱金土;曹毅;徐少駿;王樹軍;;犬脂肪基質干細胞體外抑制淋巴細胞增殖反應的初步研究[J];中華中醫(yī)藥學刊;2010年01期

3 周進;田國萍;王靜娥;徐冰;李莉;朱峰;韓建;胡鳳杰;;脂肪基質干細胞和骨髓基質干細胞的體外分化能力[J];中國組織工程研究與臨床康復;2011年32期

4 張世昌;王英杰;劉濤;李桂清;;臍帶組織來源基質干細胞的肝細胞相關標志物分析[J];胃腸病學和肝病學雜志;2009年09期

5 王紅祥;李賓公;邵詩穎;唐曉瓊;趙智剛;鄒萍;;人脂肪組織分離培養(yǎng)基質干細胞的方法及其表型鑒定[J];中國臨床康復;2006年41期

6 王利公;楊新園;王偉;;子宮內膜基質干細胞的分離培養(yǎng)研究[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2013年03期

7 阮緒芝,陳霞萍,嚴世榮,王衛(wèi)民;小鼠骨髓基質干細胞體外成骨的實驗研究[J];解剖學研究;2003年04期

8 董鴻銘,柏樹令;小鼠骨髓基質干細胞與脫細胞基質骨聯(lián)合培養(yǎng)的實驗研究[J];中國修復重建外科雜志;2005年02期

9 尚希福,黃炎,孔榮;放血增加自體骨髓基質干細胞濃度實驗研究[J];解剖與臨床;2005年02期

10 許勝;周文娟;徐欣;;脂肪基質干細胞在骨缺損中的應用現(xiàn)狀及研究新進展[J];中國口腔種植學雜志;2010年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 董鴻銘;柏樹令;;小鼠骨髓基質干細胞與脫細胞基質骨聯(lián)合培養(yǎng)的實驗研究[A];全面建設小康社會：中國科技工作者的歷史責任——中國科協(xié)2003年學術年會論文集（下）[C];2003年

2 孫立;田曉濱;胡如印;汪雷;陸延盛;;骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、血管內皮生長因子165雙基因轉染小鼠骨髓基質干細胞的體內誘導成骨[A];第六屆西部骨科論壇暨貴州省骨科年會論文匯編[C];2010年

3 楊宏梅;柏樹令;王志軍;高景恒;;小鼠骨髓基質干細胞與人耳CACM聯(lián)合培養(yǎng)的實驗研究[A];全面建設小康社會：中國科技工作者的歷史責任——中國科協(xié)2003年學術年會論文集（下）[C];2003年

4 李賓公;黃紹烈;王夢洪;鄭澤琪;彭景添;;脂肪來源與骨髓來源的基質干細胞的比較[A];第一屆全國中西醫(yī)結合心血管病中青年醫(yī)師論壇論文匯編[C];2008年

5 李賓公;黃紹烈;王夢洪;鄭澤琪;彭景添;;脂肪來源與骨髓來源的基質干細胞的比較[A];江西省第四次中西醫(yī)結合心血管學術交流會論文集[C];2008年

6 馬鈺;李青;趙大慶;王淑芳;李望舟;閔婕;谷雨;;脂肪基質干細胞的分離培養(yǎng)及其作為軟骨種子細胞的研究[A];中華醫(yī)學會病理學分會2007年學術年會暨第九屆全國病理大會論文匯編[C];2007年

7 俞斌;王忠;盧幕峻;殷德民;周廣東;劉偉;;脂肪基質干細胞體外增殖規(guī)律及上皮定向分化的實驗研究[A];第十五屆全國泌尿外科學術會議論文集[C];2008年

8 鄧展生;沈民仁;鞠洪斌;孫太存;許宇霞;張旋;;大鼠脂肪基質干細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性的實驗研究[A];第十三屆全國中西醫(yī)結合骨傷科學術研討會論文集[C];2005年

9 楊華;;超順磁性氧化鐵和多聚賴氨酸復合物標記基質干細胞及其對細胞活性的影響[A];中華醫(yī)學會第十三屆全國放射學大會論文匯編（下冊）[C];2006年

10 趙斌;馬信龍;孫曉雷;李秀蘭;馬劍雄;張揚;楊強;;兔坐骨神經勻漿上清液對脂肪基質干細胞的誘導分化作用[A];天津市生物醫(yī)學工程學會第三十三屆學術年會論文集[C];2013年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳祖亮 仇逸;一種基因給藥術可加速骨骼再生[N];新華每日電訊;2003年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 王紅祥;脂肪基質干細胞生物學特性的體外研究及免疫調節(jié)作用的機制探討[D];華中科技大學;2007年

2 張增利;骨髓來源的非粘附基質干細胞在造血重建和遺傳缺陷糾正中的作用[D];蘇州大學;2005年

3 周曉東;胎盤基質干細胞骨向分化及生物反應器構建骨組織的修復效果[D];第四軍醫(yī)大學;2005年

4 張宇坤;GDF-5在小鼠骨髓基質干細胞誘導軟骨分化過程中的實驗研究[D];華中科技大學;2007年

5 李賓公;脂肪基質干細胞移植治療急性心肌梗死的實驗研究[D];華中科技大學;2007年

6 吳雷;脂肪基質干細胞移植治療腦出血的實驗研究[D];中南大學;2009年

7 潘海濤;載基因仿生基質材料調控骨髓基質干細胞成骨定向分化的實驗研究[D];華中科技大學;2007年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐孟丹;拉布拉多犬骨髓間充質干細胞與牙周膜基質干細胞裸鼠皮下成骨能力的比較性研究[D];安徽醫(yī)科大學;2016年

2 王茜;臍帶基質干細胞的分離、鑒定及其向生殖細胞分化的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2016年

3 蘇海鵬;地塞米松對大鼠脂肪基質干細胞的成骨誘導作用[D];山西醫(yī)科大學;2007年

4 李彩霞;臍帶基質干細胞的分離、鑒定及其向生殖細胞分化的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學;2008年

5 董鴻銘;骨AECM的制備、小鼠骨髓基質干細胞培養(yǎng)，，以及聯(lián)合培養(yǎng)的實驗研究[D];中國醫(yī)科大學;2003年

6 戴翔;外周血基質干細胞培養(yǎng)鑒定及其向施萬細胞的誘導分化[D];南方醫(yī)科大學;2010年

7 張恒;BMP-2、VEGF165雙基因共表達質粒在小鼠骨髓基質干細胞的表達[D];遵義醫(yī)學院;2009年

8 冷少華;臍帶基質干細胞在不同誘導條件下向生殖細胞分化的實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2009年

9 華永新;大鼠基質干細胞成軟骨細胞過程中細胞基質黏附分子受體蛋白表達研究[D];山東大學;2005年

10 王亮亮;人β-NGF重組質粒轉染GFP轉基因的小鼠骨髓基質干細胞的實驗研究[D];桂林醫(yī)學院;2013年

本文編號：961333