本文關鍵詞：骨密質碎片法分離培養(yǎng)小鼠間充質干細胞及其生物學特性鑒定

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【摘要】：目的:建立一種從小鼠骨密質中分離培養(yǎng)間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的高效方法,并證實骨密質來源MSCs具有成骨、成脂肪和成軟骨的多向分化能力。方法:采取骨片法從C57BL/6小鼠骨密質中分離和純化MSCs,熒光倒置顯微鏡下直接觀察不同生長時期MSCs形態(tài)學特征;流式細胞術(Flow cytometry,FCM)對其進行免疫表型鑒定;取第5代MSCs進行成骨、成脂肪和成軟骨定向誘導并作組織化學染色鑒定,RT-PCR方法檢測定向誘導后特異性基因表達:骨特異性的骨鈣素(Osteocalcin,OCN)和骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)基因,脂肪特異性的脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LP)和脂肪酶(Adipsin)基因,軟骨特異性的Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)和蛋白聚糖(Aggrecan)基因。結果:接種骨密質碎片約24小時后即可見短梭狀細胞從骨碎片向周圍爬出,呈貼壁生長,經(jīng)3次傳代后即可獲得細胞形態(tài)均一、貼壁能力強、易于消化的梭形MSCs。第5代C57BL/6小鼠MSCs陽性表達CD44(99.81%)、CD29(99.77%)、Sca-1(99.76%)和CD34(94.51%),陰性表達CD45(0.86%)和CD117(0.17%)。第5代MSCs經(jīng)誘導后可成功的分化為骨、脂肪和軟骨細胞,相應茜素紅、油紅O和阿利辛藍染色成陽性,并分別表達骨特異性骨鈣素(Osteocalcin,OCN)和骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)基因,脂肪特異性脂蛋白脂酶(Lipoprotein lipase,LP)和脂肪酶(Adipsin)基因,軟骨特異性Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)和蛋白聚糖(Aggrecan)基因。結論:經(jīng)骨密質碎片法培養(yǎng)可以在較短時間內分離出更高純度的MSCs,該方法操作簡單、經(jīng)濟,穩(wěn)定性好,分離效率高,可重復性強。培養(yǎng)出的MSCs符合公認的標準(具有塑料粘附、特定的免疫表型和多向分化潛能)。
【作者單位】： 北京大學第一醫(yī)院血液科;
【關鍵詞】： 間充質干細胞 骨密質 細胞培養(yǎng) 鑒定 多向分化
【基金】：國家自然科學基金資助項目(No.30940030,81070448)
【分類號】：R329
【正文快照】： 小鼠是研究MSCs生物學特征的理想模型,然而小鼠MSCs的分離與大鼠和其它物種相比要困難很多。不同品系小鼠在相同培養(yǎng)條件下,其粘附、增殖和分化能力也不盡相同[1]。常規(guī)的全骨髓貼壁和密度梯度離心等方法分離獲得的小鼠MSCs不僅含量很低,而且純度不夠,難以滿足實驗研究的要求

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本文編號：853252