本文關(guān)鍵詞：大鼠血小板衍生生長因子C重組腺病毒載體的構(gòu)建及在內(nèi)皮祖細(xì)胞中的表達

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【摘要】：目的構(gòu)建含大鼠血小板衍生生長因子C(PDGF-C)基因的pAD-EGFP-PDGF-C的重組腺病毒表達載體,體外轉(zhuǎn)染骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)并觀察目的基因蛋白及mRNA表達情況。方法通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)法從pIRES2-EGFP-PDGF-C真核表達載體中獲得PDGF-C目的片段,經(jīng)BP重組與LR重組插入到pAD/CMV/V5-DEST,構(gòu)建pAD-PDGF-C-IRES2-EGFP腺病毒載體。酶切及DNA測序鑒定后轉(zhuǎn)染HEK293A包裝、純化,測定病毒滴度后轉(zhuǎn)染大鼠骨髓源性EPCs,應(yīng)用Real-time qPCR、蛋白免疫印跡法(Western blotting)等方法檢測PDGF-C蛋白及mRNA的表達。結(jié)果核酸內(nèi)切酶消化及PCR分析證實PDGF-C基因成功插入pAD/CMV/V5-DEST腺病毒載體,轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光蛋白表達,轉(zhuǎn)染48h后實時定量酵素聚合反應(yīng)技術(shù)(Real-time qPCR)測定EPCs中PDGF-C含量明顯提高(P0.05),Wester blotting檢測證實在46×103存在特異性條帶。結(jié)論成功構(gòu)建了大鼠PDGF-C基因的腺病毒表達載體pAD-EGFP-PDGF-C,體外轉(zhuǎn)染大鼠骨髓源性EPCs能高效表達目的基因產(chǎn)物,為后續(xù)研究PDGF-C基因功能以及進一步開展基因治療奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血管外科;
【關(guān)鍵詞】： 血小板衍生生長因子C pAD/CMV/V-DEST腺病毒載體 內(nèi)皮祖細(xì)胞 轉(zhuǎn)染
【基金】：重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研基金資助項目(2012-2-053)
【分類號】：R363
【正文快照】： 血小板衍生生長因子C(PDGF-C)是由Li等[1]新近發(fā)現(xiàn)的PDGF家族成員,活化形式為同二聚體PDGF-CC,受體為PDGFR-αα和PDGFR-αβ,分子結(jié)構(gòu)中除包含高度保守的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域外,還含有獨特的CUB結(jié)構(gòu)域[2-3]。本研究旨在以復(fù)制缺陷型腺病毒pAD/CMV/V5-DEST為載體,采用Gateway

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本文編號：827833