本文關鍵詞：腺苷A1和A2A受體在酒精性肝纖維化大鼠HSC模型中的作用及兩者間的相互作用研究

  更多相關文章： 酒精性肝纖維化 腺苷受體 重組質(zhì)粒 肝星狀細胞 活化增殖 免疫共沉淀

【摘要】：長期酗酒是引起酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)最主要的原因,而酒精性肝纖維化(alcoholic liver fibrosis, ALF)是ALD進展為酒精性肝硬化的中間階段和必經(jīng)病理過程。在酒精性肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中,乙醇可通過其中間活性代謝產(chǎn)物乙醛激活肝星狀細胞O(epatic stellate cell, HSC)。本課題組前期研究證實采用200 gM的乙醛體外刺激HSC細胞48h能成功建立大鼠酒精性肝纖維化HSC細胞模型。腺苷是一種內(nèi)源性嘌呤核苷酸,廣泛分布于機體內(nèi),且大多通過作用于細胞膜上的腺苷受體(adenosine receptors, ARs)來發(fā)揮相應的生理作用。ARs屬G-蛋白偶聯(lián)受體超家族,可分為4種亞型,即A1R、A2AR、A2BR和A3R。其中A1受體和A2a受體為高表達受體,也是4種ARs中最主要的2種亞型。近年來隨著對A1R與A2AR選擇性激動劑和拮抗劑的開發(fā),人們對兩者作用的多樣性研究越來越深入。然而,A1R與A2AR在酒精性肝纖維化HSC中的作用及兩者間的相互作用研究尚不清楚。為此,本研究選用離體HSC細胞為研究對象,采用200 μM的乙醛體外刺激HSC細胞48h來模擬大鼠酒精性肝纖維化HSC細胞模型,在模型基礎上分別過表達A1R與A2AR,在課題前期研究成果的基礎上進一步探討A1R與A2AR在酒精性肝纖維化中發(fā)揮的作用及兩者間的相互作用。目的：通過構建真核重組質(zhì)粒pEGFP-C2-A1R和pEGFP-C2-A2AR,分別瞬時轉(zhuǎn)染HSC細胞,建立A1R與A2AR在HS C細胞中的過表達模型,觀察A1R與A2AR的mRNA及其蛋白在HSC細胞中的表達。采用MTT和細胞周期測定實驗同時監(jiān)測相關基因的mRNA和蛋白表達水平,檢測A1R與A2AR分別過表達對大鼠酒精性肝纖維化HSC細胞活化增殖的影響,并通過免疫共沉淀技術聯(lián)合Western Blot方法來研究A1R與A2AR在酒精性肝纖維化HSC細胞中兩者間的相互作用。方法：從大鼠腦組織中提取目的基因A1R與A2AR,再用HindIII. KpnI對其分別進行雙酶切,并同時雙酶切載體pEGFP-C2.酶切產(chǎn)物按常規(guī)連接方法進行連接并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5a,構建pEGFP-C2-A 1 R與pEGFP-C2-A2AR真核表達質(zhì)粒。將成功構建的pEGFP-C2-A 1 R與pEGFP-C2-A2AR重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定、測序后以脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染HSC細胞,于熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達,運用RT-PCR及Western Blot分別檢測A1R與A2AR的mRNA及蛋白的表達情況,以鑒定過表達模型是否建立成功。隨后參照課題組前期研究成果采用200μM的乙醛體外刺激HSC細胞48h來建立大鼠酒精性肝纖維化HSC細胞模型,RT-PCR及Western Blot法檢測A1R與A2AR分別上調(diào)后,目的基因、α-SMA.Collagen Ⅰ和Cyclin-D1的表達變化,同時采用MTT和細胞周期測定實驗來檢測HSC細胞活化增殖情況。pEGFP-C2-A1R與pEGFP-C2-A2AR真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HSC細胞后,利用免疫共沉淀技術檢測A1R與A2AR蛋白間的相互作用。結果：1.成功構建過表達模型：經(jīng)雙酶切鑒定可見目的條帶,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后可于熒光倒置顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達。RT-PCR及Western Blot法可分別檢測出A1R和A2AR的mRNA及蛋白表達升高。2.A1R和A2AR分別過表達后對HSC細胞活化增殖的影響：在200 μM的乙醛體外刺激HSC細胞48h的情況下,發(fā)現(xiàn)A1R和A2AR分別過表達后,目的基因、α-SMA、Collagen I和Cyclin-D1的表達明顯上調(diào)。MTT結果表明模型組經(jīng)200μM乙醛作用48h后能明顯促進HSC細胞增殖,過表達組的促進作用更明顯。同時細胞周期測定結果顯示,模型組經(jīng)200μM乙醛作用48h后使分布在S期的細胞比例增多,G0/G1期的細胞比例減少。過表達組較模型組相比其分布在S期的細胞比例顯著增多,G0/G1期的細胞比例顯著減少。這提示A1R和A2AR分別過表達后能促進HSC細胞的活化增殖。3. A1R與A2AR蛋白間的相互作用：利用免疫共沉淀技術聯(lián)合Western Blot方法,同時選用最后一次的洗滌上清作為陰性對照以消除非特異性蛋白及殘留的待測目的蛋白的干擾。Western Blot結果表明,免疫沉淀復合物中能檢測到相應的目的蛋白,且免疫印跡中出現(xiàn)的條帶與HSC細胞總蛋白中的條帶位置一致而陰性對照組未檢測出條帶,表明A1R蛋白能夠與A2AR蛋白通過相互結合來發(fā)揮作用。結論：A1R和A2AR對酒精性肝纖維化大鼠HSC的活化增殖具有促進作用,免疫共沉淀證實兩者間存在相互作用。
【關鍵詞】：酒精性肝纖維化 腺苷受體 重組質(zhì)粒 肝星狀細胞 活化增殖 免疫共沉淀
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2;R-332
【目錄】：

• 英文縮略詞5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 1 前言14-15
• 2 實驗材料15-17
• 3 實驗方法17-30
• 4 實驗結果30-41
• 5 討論41-44
• 6 結論44-45
• 參考文獻45-49
• 附錄49-51
• 致謝51-52
• 綜述52-63
• 參考文獻59-63

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