本文關鍵詞：甲型副傷寒沙門菌減毒活疫苗的構建及其效能研究

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【摘要】：甲型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi A,SPA)是甲型副傷寒(paratyphoid fever A)的病原菌,主要通過糞-口途徑傳播,感染劑量約為103~109CFU/人,能夠引起類似傷寒樣的臨床癥狀。人群對甲型副傷寒沙門菌普遍易感,但以兒童和青壯年發(fā)病率最高。近年來,由甲型副傷寒沙門菌引起的腸熱癥發(fā)病率在全球很多地區(qū)呈上升趨勢,已經成為一個重大公共衛(wèi)生問題。在我國,甲型副傷寒的發(fā)病率較世界其他國家和地區(qū)更高,并在局部地區(qū)時有暴發(fā)流行。早期使用的傷寒多價滅活疫苗雖然對甲型副傷寒有預防作用,但因副反應大而不再使用,市場上尚無新的有效預防甲型副傷寒的疫苗。鑒于甲型副傷寒疫苗的公共衛(wèi)生需求越來越大,目前有必要盡快開展新的疫苗研發(fā)工作。疫苗主要包括組分疫苗(滅活疫苗類似于組分疫苗)和減毒活疫苗兩大類。組分疫苗由病原體的主要保護性抗原制備而成,包括蛋白類和多糖類抗原。易感人群通過接種一定量的抗原誘導機體產生針對該種抗原的抗體,從而對表達相關抗原的病原產生免疫防護,如傷寒沙門菌的Vi多糖疫苗,百白破三聯疫苗等;減毒活疫苗則是通過對病原菌進行遺傳改造,使其在毒力大幅度降低、安全性有保障的基礎上保留良好免疫原性,如Ty21a減毒活疫苗、麻疹減毒活疫苗和甲型肝炎減毒活疫苗等。理想的減毒活疫苗是安全性與免疫原性的最佳平衡狀態(tài)。兩類疫苗均能誘導機體產生較強的系統免疫,從而及時清除入侵機體的病原。減毒活疫苗還能誘導機體產生局部免疫,能夠有效阻止病原菌在局部的定植、增殖和感染,減少隱性感染的發(fā)生幾率,對疾病的傳播有更好的阻斷作用。甲型副傷寒通常被歸類為"旅行相關性疾病",其感染后可以形成帶菌狀態(tài),增加了旅行者傳播的危險。因此,甲型副傷寒減毒活疫苗的構建和應用更有利于機體對甲型副傷寒沙門菌感染的防護,從而控制疾病的流行。我們擬通過敲除甲型副傷寒沙門菌CMCC50093株的yncD基因和aroC基因構建一個減毒疫苗株。yncD基因為本實驗室前期篩選到的一個傷寒沙門菌體內誘導基因,研究發(fā)現,yncD基因敲除后,傷寒沙門菌毒力顯著減弱,且敲除株具有良好的免疫保護效果。在已測序的沙門菌4種主要血清型基因組中,yncD基因序列相似度在98%以上,提示yncD基因的功能在沙門菌中高度保守。aroC基因是沙門菌合成芳香族氨基酸的調控基因,敲除后會導致相應氨基酸無法合成,因此導致細菌在機體中的生長繁殖受到限制,進而導致毒力的減弱。aroc基因也是一個構建減毒株常用的靶基因。本研究中我們成功構建了一個△yncd/△aroc雙基因敲除的甲型副傷寒沙門菌減毒疫苗株。在評價其減毒效果的基礎上,對疫苗株的遺傳穩(wěn)定性、疫苗的免疫原性和安全性進行了初步評價,主要研究內容和結果如下:1.甲型副傷寒沙門菌野生株的鑒定和表型分析:甲型副傷寒沙門菌cmcc50093株購自中國藥品生物制品檢定所菌種保存中心,在本研究中作為野生株。為進一步了解野生株的生物學性狀,我們首先以ctab法提取其基因組dna,擴增16srrna基因并進行核酸測序分析,鑒定野生株。同時將培養(yǎng)菌株送我校某附屬醫(yī)院檢驗科進行生化鑒定及耐藥譜分析。結果顯示,該株菌為甲型副傷寒沙門菌,生物學性狀典型,對常用的針對革蘭陰性菌的抗生素敏感,適合用于構建減毒活疫苗。2.甲型副傷寒沙門菌△yncd/△aroc雙敲除株的構建:雙基因敲除株構建采用同源重組法進行。選用的載體為一個適用于革蘭陰性菌的自殺性敲除載體pyg4,該載體包含一個來源于r6k質粒的π蛋白依賴性復制起點orir6k,使質粒只能在表達π蛋白的菌株中復制,如e.coils17-1/λpir細菌,在其它細菌(包括沙門菌)體內則是自殺性的。pyg4質粒的正向選擇標記為卡那霉素,反向選擇標記為sacb基因,后者為來自于枯草芽胞桿菌的果聚糖蔗糖轉移酶基因,表達該蛋白的革蘭陰性菌在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長時,會將蔗糖分解為對細菌有毒的產物,從而殺死表達該蛋白的細菌,因此可以用于反向選擇。由于采用的是無痕敲除方式,即敲除目的基因后,突變株基因組中不會引入任何核酸片段,因此針對同一菌株可以反復操作,以實現多基因的敲除。在本課題研究中,我們兩次采用該自殺載體對甲型副傷寒沙門菌進行目的基因的精確敲除。我們成功獲得了甲型副傷寒沙門菌的△yncd單基因及△yncd/△aroc雙基因敲除株,核苷酸測序分析表明,在敲除的靶基因處沒有任何外源片段(包括抗性片段)插入。3.甲型副傷寒沙門菌△yncd/△aroc雙敲除株的生長曲線和ld50測定采用三線法將野生株、△yncd單敲除株和△yncd/△aroc雙敲除株接種到同一塊普通的lb平板,觀察△yncd/△aroc雙敲除株菌落生長狀況;用普通的lb液體培養(yǎng)基測定其生長曲線,利用balb/c小鼠腹腔胃黏蛋白增毒模型檢測△yncd/△aroc雙敲除株的毒力變有無化。菌落生長狀況和生長曲線結果均顯示,雙敲除株的生長狀況有了明顯改變,主要表現在生長速率和最大菌液濃度都較野生株有了顯著的降低;毒力實驗中野生株和雙敲除株分別以2.5×101,2.5×102,2.5×103,2.5×104,2.5×105,2.5×106和2.5×107cfu/只等7個接種劑量經腹腔感染小鼠,3天后計數小鼠的存活情況,并用spss軟件的probit回歸分析分別計算野生株和雙敲除株的半數致死量(ld50)。結果顯示雙敲除株的毒力僅為野生株的約1/42000,表明雙敲除株的毒力較野生株有了顯著下降。4.甲型副傷寒沙門菌△yncd/△aroc雙敲除株安全性的初步評價利用細胞實驗檢測△yncd/△aroc雙敲除株對單核巨噬細胞的侵入和胞內生存能力,用小鼠腹腔感染模型檢測感染小鼠的帶菌情況。雙敲除株、△yncd單敲除株和野生株細菌分別以5×106cfu/孔感染經pma誘導后的人單核巨噬細胞thp1,12小時后裂解細胞釋放出細菌,并用普通lb平板培養(yǎng)后對菌落進行計數。結果顯示,雙敲除株的菌落數量無論是最初的侵入數量還是在胞內培養(yǎng)后的數量都較野生株有顯著地降低,同時還發(fā)現,雙敲除株的菌落數量隨著胞內培養(yǎng)時間的延長而顯著減少,而野生株正好相反。雙敲除株和野生株細菌分別以2.5×103,2.5×104,2.5×105cfu/只的接種劑量經腹腔注射感染小鼠,接種后第7天處死小鼠,無菌取出肝、脾臟器,以pbs洗滌后勻漿,勻漿液梯度稀釋后涂布lb平板,對生長的菌落計數。結果顯示,雙敲除株在感染動物體內的生存能力也有了顯著性的降低,具體表現在野生株在2.5×104和2.5×105cfu劑量下,野生株攻擊組小鼠的臟器中有細菌存在,而雙敲除株攻擊組則在三個濃度均沒有細菌菌落生長。以上實驗初步顯示,雙敲除株的侵入能力和胞內生存能力都有了顯著降低,安全性較好。5.甲型副傷寒沙門菌△yncd/△aroc雙敲除株的免疫方式和免疫原性評價分別采用鼻黏膜接種、腹腔接種和灌胃接種三種方式對小鼠進行免疫,以測定不同的接種方式對雙敲除株免疫原性的影響;利用elisa方法檢測免疫小鼠血清抗-lps抗體滴度初步評價雙敲除株的免疫原性。結果顯示,灌胃接種組未引起小鼠的免疫反應,而鼻黏膜高濃度(2.0×109cfu/只)接種組和兩個腹腔接種組均能夠引起小鼠較好的免疫反應。以提純的傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌lps分別包被96孔板對小鼠血清中的抗-lps抗體滴度進行檢測,結果顯示,免疫接種后小鼠血清中的抗體滴度明顯高于未接種小鼠,并且兩種lps的抗體滴度相差不大。沙門菌lps被認為是沙門菌主要保護性抗原之一,實驗結果表明,雙敲除株具有良好的免疫原性。6.甲型副傷寒沙門菌△yncd/△aroc雙敲除株的免疫保護性評價免疫小鼠血清中針對傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌的lps的抗體滴度接近,表明小鼠可能存在針對傷寒沙門菌的交叉免疫。采用甲型副傷寒沙門菌野生株和傷寒沙門菌Ty2菌株分別對免疫接種后的小鼠進行毒力攻擊,以檢測雙敲除株的免疫保護作用和交叉免疫保護效果。我們采用鼻黏膜高濃度(2.0×109 CFU/只)接種對小鼠進行免疫,同時設置PBS對照。野生株和Ty2株攻擊均采用2.5×101,2.5×102,2.5×103,2.5×104,2.5×105,2.5×106CFU/只6個劑量。結果顯示,免疫后的小鼠和對照小鼠相比較,對甲型副傷寒沙門菌有很好的免疫防護作用,而針對Ty2卻只在低劑量(2.5×101 CFU)時才和對照組顯示出明顯的差異,其是否能起到交叉保護效果尚待進一步實驗論證。采用ELISA方法檢測免疫小鼠在受到毒株攻擊時,血清中IL-6、IL-12和TNF-a等炎癥因子的變化。野生株致死劑量對免疫小鼠和對照小鼠進行腹腔接種,接種后的20小時內每4小時取血一次,并檢測血清中的炎癥因子。結果顯示,免疫組和對照組的炎癥因子都有上升,但免疫小鼠上升幅度顯著低于對照小鼠,同時消退時間縮短,表明雙敲除株的免疫能增強細菌的清除,進而減低宿主的炎癥反應,具有良好的保護作用。
【關鍵詞】：甲型副傷寒沙門菌 減毒活疫苗 yncD基因 aroC基因 交叉免疫
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 英文縮寫4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 甲型副傷寒沙門菌△ync D/△aro C雙敲除株的構建16-44
• 2.1 材料與方法17-33
• 2.2 結果33-41
• 2.3 討論41-44
• 第三章 甲型副傷寒沙門菌△ync D/△aro C雙敲除株的初步效能研究44-64
• 3.1 材料與方法44-56
• 3.2 結果56-62
• 3.3 討論62-64
• 全文小結64-65
• 參考文獻65-70
• 文獻綜述 甲型副傷寒及其病原體研究進展70-87
• 參考文獻78-87
• 攻讀學位期間的研究成果及參與的課題87-88
• 致謝88

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