本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌epsilon毒素突變體疫苗的相關(guān)基礎(chǔ)研究

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【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)廣泛存在于自然界和動(dòng)物的腸道中,是一種重要的人獸共患傳染病的病原體之一。該菌可產(chǎn)生多種外毒素,根據(jù)其中的四種主要外毒素α、β、ε以及ι可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為五個(gè)型別,分別是A、B、C、D和E型。在四種主要的外毒素中,由B和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的ε毒素是一種劇烈的致病因子,能夠?qū)е赂嵫蚝蜖倥５哪c道致死性疾病以及綿羊和山羊等動(dòng)物的壞死性腸炎或者腸毒血癥。由于ε毒素所導(dǎo)致動(dòng)物的以上疾病具有發(fā)病急、死亡快及病程短等特點(diǎn),使抗生素的治療沒有顯著的意義,給世界各地的畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防動(dòng)物壞死性腸炎和腸毒血癥最有效的方法是注射疫苗,和傳統(tǒng)的ε毒素的脫毒疫苗相比,重組ε毒素的減毒疫苗的研究正在成為熱點(diǎn)。本研究首先通過結(jié)構(gòu)變化和定點(diǎn)突變的方法篩選減毒或無毒的ETX突變體蛋白,具體方法是以本實(shí)驗(yàn)室留存的分別帶有pET-His-etx和pTIG-etx載體的菌株為基礎(chǔ),根據(jù)QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit操作說明書設(shè)計(jì)多對定點(diǎn)突變引物,通過PCR擴(kuò)增技術(shù)分別對兩個(gè)載體進(jìn)行多位點(diǎn)的定點(diǎn)突變,將PCR產(chǎn)物用DpnI酶(可專一消化帶有甲基化的DNA)消化后進(jìn)行測序驗(yàn)證,將測序無誤的載體轉(zhuǎn)化到到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coli BL21(DE3)pLysS中。挑取單克隆菌落于5 m L的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),將擴(kuò)增后的菌液保存在冰箱,同時(shí)進(jìn)行測序鑒定,鑒定正確的菌體按照1:100的比例轉(zhuǎn)接到500 mL LB培養(yǎng)基中,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至A600值0.6-0.8時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)劑,使其終濃度為1 mM,然后置于16℃的搖床中過夜誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)后的菌液8000 r/min離心15 min后去上清,沉淀用PBS重懸后再次離心去上清,沉淀用100 mL蛋白純化A液重懸后,超聲破碎菌體。破碎的懸液在8000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心15 min收集上清,隨后上清用0.45μm孔徑大小的濾膜過濾后備用,用NaOH溶液清洗純化儀,然后使蛋白純化A液進(jìn)入純化儀,緊接著進(jìn)過濾后的上清,再進(jìn)一次蛋白純化A液后進(jìn)蛋白純化B液,使用Ni2+柱對誘導(dǎo)后的蛋白進(jìn)行純化,SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)對純化后的蛋白純度鑒定,western-blot實(shí)驗(yàn)對蛋白的抗原性進(jìn)行鑒定。將超濾濃縮后的各突變體蛋白進(jìn)行細(xì)胞毒性和動(dòng)物毒力實(shí)驗(yàn),分別用MTS法和改良寇式法計(jì)算細(xì)胞的CT50和小鼠的LD50以此驗(yàn)證各突變體蛋白的減毒效果。將減毒效果比較明顯的epsilon毒素各突變體蛋白進(jìn)行后續(xù)系列實(shí)驗(yàn),以此闡明突變體蛋白的減毒機(jī)制。首先選取對etx敏感的mdck細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn),將不同濃度的各突變體蛋白和mdck細(xì)胞孵育后,用4%的多聚甲醛固定15min,用5%的bsa封閉后和anti-his單克隆抗體孵育,最后和hrp熒光基團(tuán)標(biāo)記的羊抗鼠igg孵育。分別用多功能讀板儀和激光共聚焦顯微鏡對mdck細(xì)胞表面的各突變體蛋白進(jìn)行檢測。隨后對突變體蛋白在mdck細(xì)胞上的七聚體形成能力進(jìn)行檢測,將突變體蛋白和mdck細(xì)胞孵育后高溫裂解細(xì)胞,用裂解后的細(xì)胞液懸液進(jìn)行western-blot實(shí)驗(yàn)。然后使用鈣離子探針檢測突變體蛋白的成孔能力,將鈣離子探針和mdck細(xì)胞孵育后清洗干凈,用含有cacl2的hbss緩沖液將突變體蛋白稀釋到不同的濃度,將稀釋好的緩沖液和mdck細(xì)胞孵育,并實(shí)時(shí)在多功能讀板儀中連續(xù)讀取熒光值,以熒光值的變化來反映突變體蛋白的成孔能力。最后采用圓二色譜實(shí)驗(yàn)對各突變體蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測,以pbs作為背景,測定蛋白在190-260nm處的紫外吸收。選取四種突變體蛋白中減毒幅度最大的retxy196e-c蛋白作為抗原進(jìn)行小鼠的免疫實(shí)驗(yàn)。首先對抗原的免疫劑量和免疫途徑進(jìn)行優(yōu)化,將balb/c小鼠隨機(jī)分為7組,每組20只,設(shè)置三個(gè)抗原免疫劑量和兩個(gè)免疫途徑,7個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別是5μg皮下免疫組,5μg腹腔免疫組,10μg皮下免疫組,10μg腹腔免疫組,15μg皮下免疫組,15μg腹腔免疫組和1個(gè)pbs免疫組。小鼠共免疫三次,每兩天測量一次小鼠體重,每次免疫一周后尾靜脈采血進(jìn)行elisa檢測小鼠血清抗體效價(jià),在第三次免疫一周后取部分小鼠進(jìn)行天然毒素的攻毒實(shí)驗(yàn),蛋白免疫組的小鼠設(shè)置三個(gè)劑量,分別是100×ld50,500×ld50和1000×ld50天然毒素,而pbs免疫組的小鼠設(shè)置一個(gè)10×ld50天然毒素攻毒劑量。另一部分小鼠取脾臟和全血,小鼠的脾臟經(jīng)過裂解破碎后對其中t淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色,用流式細(xì)胞儀檢測小鼠t淋巴細(xì)胞中兩種細(xì)胞因子il-4和ifn-γ的比例。小鼠的全血經(jīng)離心后取上清和等體積的重組天然毒素retx在37℃孵育30min后加入到mdck細(xì)胞或腹腔注射到正常小鼠體內(nèi),觀察免疫后小鼠血清的體外中和能力。為了驗(yàn)證由突變體蛋白retxy196e-c刺激小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體與天然毒素retx和retxy196e-c之間的親和力差別,將兩種蛋白包被在酶聯(lián)板中,分別和小鼠的血清或單克隆抗體孵育,用不同濃度的nh4scn洗脫的方式進(jìn)行親和力指數(shù)的測定。通過本研究方法,成功構(gòu)建和表達(dá)了四種etx突變體蛋白retx、retx-c、retxy196e以及retxy196e-c,并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了c-末端和196位氨基酸突變都能減弱epsilon毒素的毒性且兩種因素之間存在協(xié)同作用,其中c-末端主要通過影響epsilon毒素與靶細(xì)胞的結(jié)合繼而影響了成孔和七聚體的形成來減弱epsilon毒素的毒性,而196位氨基酸突變只是微弱的影響了成孔和七聚體的形成。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,突變體蛋白rETX-C和rETXY196E的小鼠LD50值為110,000,rETX的小鼠LD50值為7910,而突變體蛋白rETXY196E-C的小鼠LD50值為1770,000。說明只突變Y196位氨基酸或只加入C-末端時(shí),其對細(xì)胞和動(dòng)物的毒性減弱幅度相似,Y196為氨基酸突變一定通過某種機(jī)制影響了epsilon毒素的毒性,但是具體是通過哪種機(jī)制還沒有完全闡明。動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,減毒幅度最大的突變體蛋白rETXY196E-C能夠較好的刺激小鼠免疫系統(tǒng),使其產(chǎn)生較多且同時(shí)具有體內(nèi)體外中和活性的抗體。在6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中,15μg皮下免疫組的小鼠80%能夠抵抗1000×LD50天然毒素的攻擊,皮下免疫組的小鼠能夠抵抗500×LD50天然毒素的攻擊,而腹腔免疫組的小鼠只能抵抗100×LD50天然毒素的攻擊。病理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PBS免疫組的小鼠在經(jīng)過1000×LD50天然毒素的攻擊后,小鼠的腦部出現(xiàn)了大量的空泡狀壞死,小鼠的腎出現(xiàn)了嚴(yán)重的出血壞死。而15μg劑量組皮下免疫方式的小鼠在遭受1000×LD50天然毒素的攻擊后,其腎臟和腦部的病變壞死得到了明顯的改善。以上結(jié)果表明,免疫后的小鼠能夠明顯減弱天然毒素對其敏感器官的損傷。說明皮下免疫方式優(yōu)于腹腔免疫,15μg劑量優(yōu)于其他兩個(gè)劑量。抗原抗體親和力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,由蛋白rETXY196E-C刺激小鼠產(chǎn)生的抗體與rETX和rETXY196E-C之間的親和力沒有顯著差別。因此,通過這種結(jié)構(gòu)變化和定點(diǎn)突變的方式篩選epsilon毒素候選疫苗是可行的,同時(shí)重組蛋白rETXY196E-C具有較好的免疫原性和安全性,可作為ETX的候選疫苗研究,具有廣闊的前景。
【關(guān)鍵詞】：產(chǎn)氣莢膜梭菌 epsilon毒素 定點(diǎn)突變 重組疫苗 腸毒血癥
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 第一部分 產(chǎn)氣莢膜梭菌epsilon毒素減毒突變體的構(gòu)建及減毒機(jī)制的研究14-35
• 1 材料與方法15-21
• 1.1 材料和試劑15
• 1.2 主要儀器15
• 1.3 細(xì)菌的培養(yǎng)，質(zhì)粒的提取15
• 1.4 突變引物的設(shè)計(jì)15-16
• 1.5 突變基因引入載體16-17
• 1.6 突變質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、鑒定17-18
• 1.7 突變體蛋白的表達(dá)、純化18
• 1.8 各突變體蛋白的濃縮、定量18-19
• 1.9 突變體蛋白的動(dòng)物毒力實(shí)驗(yàn)19
• 1.10 減毒突變體蛋白的免疫實(shí)驗(yàn)19
• 1.11 突變體蛋白的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)19
• 1.12 突變體蛋白的七聚體形成實(shí)驗(yàn)19
• 1.13 突變體蛋白和MDCK細(xì)胞的結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)19-20
• 1.14 減毒突變體蛋白的成孔能力實(shí)驗(yàn)20
• 1.15 圓二色譜實(shí)驗(yàn)20-21
• 2 結(jié)果21-33
• 2.1 PCR鑒定結(jié)果21-22
• 2.2 定點(diǎn)突變后基因測序結(jié)果比對22-23
• 2.3 蛋白表達(dá)與純化23-27
• 2.4 蛋白定量27-28
• 2.5 突變體蛋白的動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)28
• 2.6 四種突變體蛋白的western-blot實(shí)驗(yàn)28-29
• 2.7 減毒重組蛋白的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)29
• 2.8 四種減毒重組蛋白的七聚體形成實(shí)驗(yàn)29-30
• 2.9 減毒重組蛋白的細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)30-31
• 2.10 重組蛋白的成孔能力比較31-32
• 2.11 圓二色譜實(shí)驗(yàn)32-33
• 3 討論33-35
• 第二部分 重組減毒突變體蛋白rETX~(Y196E)-C的小鼠免疫效果評價(jià)35-48
• 1 材料與方法36-40
• 1.1 材料36
• 1.2 突變體蛋白rETX~(Y196E)-C熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)36-37
• 1.3 小鼠的領(lǐng)取和培養(yǎng)37
• 1.4 減毒蛋白和佐劑混合及動(dòng)物免疫37
• 1.5 免疫后小鼠的攻毒實(shí)驗(yàn)37
• 1.6 小鼠血清的抗體效價(jià)測定及抗原抗體的親和力測定37-38
• 1.7 免疫后小鼠血清的體外中和實(shí)驗(yàn)38
• 1.8 病理損傷實(shí)驗(yàn)38
• 1.9 免疫小鼠體內(nèi)的細(xì)胞因子檢測38-40
• 2 結(jié)果40-46
• 2.1 蛋白的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)40
• 2.2 免疫過程中小鼠體重變化40-41
• 2.3 免疫后小鼠的攻毒實(shí)驗(yàn)41-42
• 2.4 免疫后小鼠血清的抗體效價(jià)42-43
• 2.5 抗原抗體親和力實(shí)驗(yàn)43
• 2.6 體外中和實(shí)驗(yàn)43-44
• 2.7 病理損傷實(shí)驗(yàn)44-45
• 2.8 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)45-46
• 3 討論46-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 附錄52-54
• 個(gè)人簡歷54-55
• 致謝55

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本文編號：798205