發(fā)布時間：2017-08-23 01:21

  本文關(guān)鍵詞：生物素AP-tagged-FOXMl的表達體系構(gòu)建及蛋白互作初探

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【摘要】：生物素AP-tag技術(shù)是指在目的蛋白的N端或C端加上由15個氨基酸(GLND IFEAQKIEWHE)組成的受體肽(acceptor peptide, AP)小標簽,該小標簽可被生物素連接酶BirA特異性識別,BirA酶可催化生物素轉(zhuǎn)移到靶標蛋白標簽上的賴氨酸殘基上,導致帶有標簽的靶標蛋白在體內(nèi)或體外都能被生物素化。該生物素化過程為酶促反應,反應條件相當溫和而且標記的專一性極高。生物素AP-tag技術(shù)具有高效、位點特異及操作方便等特點,同時由于序列短小,對靶標蛋白的構(gòu)象及活性影響極低。鏈霉親和素可以專一地與生物素結(jié)合,且兩者間的結(jié)合力是自然界已知的最強的非共價結(jié)合作用力,結(jié)合常數(shù)Kd值高達10-15mol/L,比抗原與抗體間的結(jié)合力高1萬倍。因此,可在嚴格的洗脫條件下分離出目標蛋白及其蛋白特異性相互作用的復合物。FOXM1是Forkhead box轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一,它與細胞增殖、衰老、DNA損傷修復、再生和腫瘤等許多生理病理過程都有密切關(guān)系。本課題構(gòu)建基于生物素AP-tag的FOXM1真核表達載體,利用生物素與鏈霉親和素的高特異性、高親和力的結(jié)合性質(zhì)對FOXM1蛋白進行純化,為后續(xù)鑒定其互作分子的研究奠定基礎(chǔ)。分別構(gòu)建真核表達載體pcDNA-AP-FOXM1和大腸桿菌生物素連接酶BirA真核表達載體pcDNA-BirA,將pcDNA-AP-FOXM1和pcDNA-BirA共轉(zhuǎn)染人胚腎293T細胞,使用鏈霉親和素瓊脂糖珠純化生物素標記的FOXM1,通過銀染及Western印跡檢測細胞裂解液以及親和純化后的蛋白復合物,確定了相關(guān)蛋白表達情況。研究發(fā)現(xiàn)AP-FOXM1在HEK293T細胞中被生物素化且該蛋白在Western印跡、pull down等實驗中可實現(xiàn)無需抗體的一步法應用。另外,分別構(gòu)建了的pcDNA-AP-FOXM1 (1-224aa)和pcDNA-AP-FOXM1(1-353aa),在細胞內(nèi)表達不同長度的可生物素化的FOXM1,并驗證了FOXM1的互作蛋白p-catenin與FOXM1的C端發(fā)生互作,為研究FOXM1與其他蛋白的細節(jié)互作關(guān)系提供了有效工具。
【關(guān)鍵詞】：生物素AP-tag FOXM1 BirA酶 親和純化 蛋白互作
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-21
• 1.1 生物素AP-tag技術(shù)概述10-11
• 1.2 生物素連接酶BirA的簡介11-13
• 1.2.1 生物素簡介11-12
• 1.2.2 生物素連接酶BirA概述12
• 1.2.3 BirA酶的結(jié)構(gòu)12-13
• 1.2.4 BirA酶的功能13
• 1.3 鏈霉親和素簡介13-14
• 1.4 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的概述14-17
• 1.4.1 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的結(jié)構(gòu)14
• 1.4.2 轉(zhuǎn)錄因子FOXM1的功能14-17
• 1.5 β-catenin的概述17
• 1.6 FOXM1蛋白互作概述17-18
• 1.7 研究目的、內(nèi)容與意義18-21
• 第2章 生物素化FOXM1真核表達體系的構(gòu)建21-36
• 2.1 前言21
• 2.2 實驗材料與儀器21-23
• 2.3 實驗方法23-32
• 2.3.1 BirA酶重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建23-29
• 2.3.2 生物素化FOXM1重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建29-32
• 2.4 結(jié)果與分析32-35
• 2.4.1 pcDNA-BirA重組表達載體的構(gòu)建及鑒定32-33
• 2.4.2 pcDNA-AP-FOXM1重組表達載體的構(gòu)建及鑒定33-35
• 2.5 本章小結(jié)35-36
• 第3章 AP-FOXM1的生物素化和純化36-47
• 3.1 前言36
• 3.2 實驗材料與儀器36-38
• 3.3 實驗方法38-43
• 3.3.1 細胞培養(yǎng)38-39
• 3.3.2 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實驗39
• 3.3.3 蛋白免疫印跡法(Western Blot)39-42
• 3.3.4 蛋白純化42
• 3.3.5 硝酸銀染色42-43
• 3.4 結(jié)果與分析43-46
• 3.4.1 重組質(zhì)粒在真核細胞中的表達及生物素化43-44
• 3.4.2 生物素化的AP-FOXM1一步純化44-45
• 3.4.3 生物素化的FOXM1硝酸銀染色分析45-46
• 3.5 本章小結(jié)46-47
• 第4章 生物素AP-tagged-FOXM1的蛋白互作初步研究47-57
• 4.1 前言47-48
• 4.2 實驗材料與儀器48-50
• 4.3 實驗方法50-54
• 4.3.1 pcDNA3.1-AP-FOXM1不同片段長度重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定50-53
• 4.3.2 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實驗53
• 4.3.3 蛋白免疫印跡法(Western Blot)53-54
• 4.3.4 蛋白純化54
• 4.4 結(jié)果與分析54-56
• 4.4.1 pcDNA-AP-FOXM1不同片段長度重組表達載體的構(gòu)建及鑒定54
• 4.4.2 基于生物素AP-tag技術(shù)的FOXM1的互作蛋白檢測54-56
• 4.5 本章小結(jié)56-57
• 總結(jié)與展望57-59
• 參考文獻59-65
• 附錄A 英文縮寫65-66
• 附錄B 常用緩沖液和試劑配方66-67
• 附錄C 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文目錄67-68
• 致謝68

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1 王義琴,孫勇如;生物素-親合素系統(tǒng)及其應用[J];高技術(shù)通訊;2000年03期

2 白麗;生物素化抗細胞因子單克隆抗體的制備[J];免疫學雜志;2001年03期

3 方華豐,周宜開,任恕;生物素化殼聚糖微球的體外抗癌活性[J];藥學學報;2000年05期

4 宋娜;郝友華;張正茂;吳s，

本文編號：722181