本文關(guān)鍵詞：利用脂肪細胞和腸上皮細胞特異性敲除小鼠研究Metrnl表達和功能

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【摘要】：背景脂肪因子在調(diào)控脂肪組織功能和機體代謝方面發(fā)揮著重要作用。Metrnl是我們課題組新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子。該蛋白在機體多種組織中表達,尤其在白色脂肪和粘膜組織中高表達。目前文獻報道,Metrnl具有神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用,促進軸突生長和神經(jīng)細胞遷移;脂肪形成和肥胖時Metrnl表達上調(diào)。本課題研究Metrnl組織表達譜,聚焦于Metrnl高表達的脂肪組織和腸道組織,通過創(chuàng)制細胞特異性基因敲除小鼠探索Metrnl功能。方法1.考察小鼠Metrnl ELISA試劑盒的靈敏度、精確度、特異性等,建立一套穩(wěn)定準確的Metrnl檢測方法。2.利用Metrnlloxp/loxp小鼠和Fabp4-Cre小鼠交配,制備Metrnl脂肪細胞特異性敲除小鼠。3.正常飲食下,取Metrnl脂肪細胞特敲小鼠和野生型小鼠脂肪組織、肝臟、肌肉、心臟和腦組織檢測Metrnl mRNA水平,利用ELISA方法檢測Metrnl血液水平。另外,監(jiān)測小鼠能量消耗和進行葡萄糖耐量實驗。高脂飲食下,監(jiān)測Metrnl脂肪細胞特敲小鼠和野生型小鼠能量消耗,并進行葡萄糖耐量實驗和胰島素耐量實驗。HE染色觀察小鼠白色脂肪組織形態(tài)和real-time PCR分析棕色脂肪脂代謝和產(chǎn)熱相關(guān)基因表達。4.利用正常人組織芯片進行Metrnl免疫組織化學分析,以及利用real-time PCR方法分析C57BL/6小鼠組織Metrnl mRNA表達。5.利用Metrnlloxp/loxp小鼠和Villin-Cre小鼠交配,制備Metrnl腸上皮細胞特異性敲除小鼠。6.考察Metrnl腸上皮細胞特敲小鼠和野生型小鼠體重和結(jié)腸長度,HE染色觀察結(jié)腸形態(tài)和利用ELISA方法檢測血液和腸液Metrnl水平。腸道粘液染色分析腸道粘蛋白的分泌,以及利用real-time PCR方法分析腸上皮細胞中抗菌肽mRNA表達水平如Regenerating islet-derived 3 gamma(Reg3g)、Lactortansfferin、Serum amyloid a-3(SAA3)和Regenerating islet-derived 3 beta(Reg3b)。結(jié)果1.建立了一套成熟穩(wěn)定準確的Metrnl ELISA檢測方法。該方法靈敏度高,精密度的變異系數(shù)為5-15%,且只能由于檢測小鼠血液Metrnl,大鼠和人血液都不能檢測。另外,小鼠血液的采集方法必須一致,否則影響Metrnl值的比較。2.成功制備Metrnl脂肪細胞特異性敲除小鼠模型。脂肪組織Metrnl表達下降57%,而肝臟、肌肉、心臟和腦組織Metrnl表達不改變。Metrnl脂肪細胞特異性敲除后小鼠血液水平有降低趨勢,無顯著差異。3.正常飲食下,與野生型小鼠相比,Metrnl脂肪細胞特異性敲除小鼠的能量消耗和葡萄糖耐受能力不受影響。高脂飲食下,與野生型小鼠相比,Metrnl脂肪細胞特敲小鼠白色脂肪細胞顯著變小,機體胰島素抵抗加重,但棕色脂肪脂代謝和產(chǎn)熱相關(guān)基因mRNA表達無明顯變化。4.正常人組織Metrnl免疫組化和C57BL/6小鼠組織Metrnl mRNA表達水平表明,Metrnl在人和小鼠組織中表達譜幾乎一致,且腸上皮細胞Metrnl表達最高。5.成功制備Metrnl腸上皮細胞特異性敲除小鼠模型。腸上皮細胞Metrnl表達下降96%,而肝臟、肌肉、心臟和脂肪組織Metrnl表達不改變。Metrnl腸上皮細胞特敲后小鼠血液水平有降低趨勢無顯著差異,而腸液Metrnl水平顯著降低。6.與野生型小鼠相比,Metrnl腸上皮細胞特敲小鼠體重和結(jié)腸長度,結(jié)腸形態(tài)也沒有顯著變化。腸道粘液染色沒有發(fā)現(xiàn)其分泌有明顯變化,腸上皮Mucin2表達也沒有差異。但腸上皮細胞中抗菌肽mRNA表達減少如Reg3g和Lactotransfferin分泌顯著減少,SAA3和Reg3b有減少趨勢。結(jié)論Metrnl脂肪細胞特異性敲除不會引起血液Metrnl水平顯著下降;Metrnl腸上皮細胞特異性敲除不會引起血液Metrnl水平顯著下降,但導致腸液Metrnl水平顯著降低。脂肪細胞Metrnl能增強機體胰島素敏感性;腸上皮細胞Metrnl能促進腸上皮細胞抗菌肽表達,Metrnl可能參與腸道免疫調(diào)節(jié)。
【關(guān)鍵詞】：Metrnl ELISA 脂肪細胞 胰島素敏感性 腸上皮細胞 抗菌肽
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-12
• 前言12-16
• 一、實驗材料16-19
• （一）試劑和耗材16-17
• （二）實驗儀器17-19
• 二、實驗方法19-29
• （一）小鼠基因型鑒定19-20
• （二）小鼠體重、食量記錄和能量消耗測定20-21
• （三）葡萄糖耐量實驗21
• （四）胰島素耐量實驗21-22
• （五）小鼠血液標本和腸液標本采集22
• （六）組織形態(tài)學實驗22-24
• （七）Metrnl等基因mRNA表達檢測24-26
• （八）Metrnl免疫組織化學檢測26
• （九）Metrnl ELISA檢測26-29
• 三、實驗結(jié)果與討論29-43
• （一）Metrnl ELISA方法學考察29-32
• 1. 檢測方法的靈敏度29
• 2. 檢測方法的精密度29-30
• 3. 檢測上限的延伸30
• 4. 檢測方法的種屬特異性30-31
• 5. 不同血液的采集方法對Metrnl的影響31-32
• （二）Metrnl脂肪細胞特敲小鼠培育和胰島素敏感性研究32-38
• 1. Metrnl脂肪細胞特異性敲除小鼠的培育32
• 2. Metrnl脂肪細胞特異性敲除小鼠的驗證32-33
• 3. 正常飲食下，Metrnl對小鼠體重、食量和能量消耗的影響33
• 4. 正常飲食下，，Metrnl脂肪細胞特敲對胰島素敏感性的影響33-34
• 5. 高脂飲食下，Metrnl對小鼠體重、食量和能量消耗的影響34
• 6. 高脂飲食下，Metrnl脂肪細胞特敲對胰島素敏感性的影響34-35
• 7. 高脂飲食下，Metrnl對小鼠肝臟和脂肪組織重量的影響35-36
• 8. 高脂飲食下，Metrnl對棕色脂肪脂代謝和產(chǎn)熱功能的影響36
• 9. 高脂飲食下，Metrnl脂肪細胞特敲對白色脂肪組織形態(tài)的影響36-38
• （三）Metrnl腸上皮細胞特敲小鼠培育和功能探索38-43
• 1. 正常人組織Metrnl表達譜38
• 2. C57BL/6 小鼠組織Metrnl表達譜38-39
• 3. Metrnl腸上皮細胞特異性敲除小鼠的培育39-40
• 4. Metrnl腸上皮細胞特異性敲除小鼠的驗證40
• 5. Metrnl腸上皮細胞特敲小鼠體重和結(jié)腸形態(tài)學觀察40-41
• 6. Metrnl腸上皮細胞特敲小鼠血液和腸液Metrnl水平41
• 7. Metrnl對小鼠腸道粘液分泌和抗菌肽表達的影響41-43
• 全文總結(jié)43-44
• 參考文獻44-48
• 綜述48-59
• 參考文獻54-59
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況59-60
• 附錄60-72
• 致謝72

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本文編號：709016