本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌表面展示結(jié)核分枝桿菌PepA、PPE18和EsxH蛋白及其免疫原性研究

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【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的人、畜、禽共患的慢性消耗性傳染病,與艾滋病及瘧疾共同成為人類健康的三大威脅。2013年,有900萬人罹患結(jié)核病,150萬人死于該病。隨著耐藥結(jié)核分枝桿菌的散播及艾滋病蔓延,對結(jié)核病的控制與防治面臨著巨大挑戰(zhàn)。但是,目前已報道的針對結(jié)核病的幾種疫苗都有一定的局限性。接種卡介苗(BCG)是預防結(jié)核病的主要方式,但存在保護效率低、免疫保護效果有限等問題;DNA疫苗的有效性仍有待提高;亞單位疫苗的免疫應(yīng)答持續(xù)時間短、應(yīng)用受限,因此發(fā)展高效、安全并可廣泛應(yīng)用的新型結(jié)核疫苗已迫在眉睫。本研究通過構(gòu)建細菌表面展示載體,在大腸桿菌表面展示結(jié)核分枝桿菌PepA、PPE18和EsxH蛋白,對其免疫效果進行研究,評價其作為活載體疫苗應(yīng)用于結(jié)核病防控的潛力。本研究將PepA、PPE18和EsxH的編碼基因rv0125、rv1196、rv0288及三個基因的融合基因rv0288-1196-0125分別克隆于構(gòu)建的INP表面展示載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,通過不同方法驗證外源蛋白的表達定位和表達量。免疫印跡結(jié)果顯示,三個編碼基因及融合基因均有表達,可檢測到預期大小的蛋白條帶;對亞細胞組分的檢測結(jié)果顯示,目的蛋白均定位于細胞膜與細胞壁;進一步應(yīng)用蛋白酶K作用后,特異性的目的蛋白被消化,被降解為許多小分子量氨基酸肽段;激光共聚焦顯微鏡下可觀察到免疫染色后細菌表面的特異性熒光信號。以小鼠為動物模型,用所構(gòu)建的表面展示活疫苗載體經(jīng)腹腔注射免疫小鼠,定期采取血清、分離脾臟淋巴細胞,分別檢測抗體水平、細胞因子水平、CD4+和CD8+水平,分析免疫效果。研究結(jié)果表明,與對照組相比,各免疫組抗體水平均有較大程度的提升,在三免二周后,INP-0288組的抗體水平為空載體對照組的4倍,既使抗體水平最低的INP-0288-1196-0125組也為空載體對照組2倍,顯示上述表面展示活疫苗載體能刺激機體產(chǎn)生針對所展示蛋白的高水平特異性抗體。各免疫組CD4+T細胞呈現(xiàn)上升趨勢,而對于CD8+T細胞,INP-0288免疫組呈現(xiàn)上升趨勢,其余三組呈現(xiàn)上升后輕微下降的趨勢,但水平均高于對照組;INP-0288組的CD4+/CD8+表現(xiàn)為上升后輕微下降的趨勢,其余三組呈現(xiàn)出下降后上升的趨勢。細胞因子水平存在明顯差異:對于IFNγ,相比于空白組各免疫組水平均表現(xiàn)為下降,水平低于空白組;對于IL-4,各時間點各免疫組水平明顯提高;IL-17A的檢測中,相比于空白組,INP-0288組明顯升高,而其余三組表現(xiàn)為水平降低。綜上所述,本研究利用所構(gòu)建的表面展示載體INP,將結(jié)核分枝桿菌PepA、PPE18、EsxH及其融合蛋白展示于大腸桿菌表面,所構(gòu)建的4種蛋白表面展示活疫苗載體均能夠在小鼠中激發(fā)強烈的體液與細胞免疫。本研究為新型結(jié)核疫苗的研制奠定了良好的基礎(chǔ),為結(jié)核病的防控提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：分枝桿菌 表面展示 PepA PPE18 EsxH
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-22
• 1.1 結(jié)核病簡介12-16
• 1.1.1 結(jié)核病病原學12-13
• 1.1.2 結(jié)核病流行病學13-14
• 1.1.3 結(jié)核病的防控14-16
• 1.2 細菌表面展示系統(tǒng)的發(fā)展與應(yīng)用16-18
• 1.3 冰核蛋白展示系統(tǒng)18
• 1.4 PepA, PPE18, EsxH18-21
• 1.5 研究目的和意義21-22
• 第二章 結(jié)核分枝桿菌PepA、PPE18和Esx H蛋白表面展示疫苗載體的構(gòu)建22-37
• 2.1 實驗材料22-24
• 2.1.1 載體和菌株22
• 2.1.2 主要試劑22
• 2.1.3 主要儀器22
• 2.1.4 主要溶液及培養(yǎng)基22-24
• 2.2 實驗方法24-29
• 2.2.1 引物設(shè)計與基因PCR擴增24-25
• 2.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建25-26
• 2.2.3 重組菌的構(gòu)建26
• 2.2.4 激光共聚焦檢測26-27
• 2.2.5 目的蛋白的SDS-PAGE、免疫印跡檢測27
• 2.2.6 目的蛋白超速離心法分離組分27
• 2.2.7 目的蛋白蛋白酶K處理27-28
• 2.2.8 目的蛋白激光共聚焦觀察28-29
• 2.3 實驗結(jié)果29-36
• 2.3.1 基因PCR擴增結(jié)果29-30
• 2.3.2 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果30
• 2.3.3 EGFP激光共聚焦檢測結(jié)果30-31
• 2.3.4 目的蛋白免疫印跡檢測結(jié)果31-32
• 2.3.5 目的蛋白超速離心法分離組分結(jié)果32-34
• 2.3.6 目的蛋白的蛋白酶K消化結(jié)果34-35
• 2.3.7 目的蛋白激光共聚焦觀察結(jié)果35-36
• 2.4 討論36-37
• 第三章 結(jié)核分枝桿菌PepA, PPE18和Esx H蛋白表面展示疫苗免疫效果評價37-48
• 3.1 實驗材料37-38
• 3.1.1 實驗動物37
• 3.1.2 試劑37
• 3.1.3 主要儀器37
• 3.1.4 主要溶液37-38
• 3.2 實驗方法38-40
• 3.2.1 小鼠免疫38
• 3.2.2 多肽包被ELISA法檢測抗體效價38-39
• 3.2.3 細胞壁組分包被ELISA法檢測抗體效價39
• 3.2.4 小鼠脾臟淋巴細胞的分離39
• 3.2.5 流式細胞術(shù)檢測CD4+T和CD8+T細胞39
• 3.2.6 小鼠外周血細胞因子的檢測39-40
• 3.3 實驗結(jié)果40-45
• 3.3.1 多肽包被ELISA法檢測抗體水平40-41
• 3.3.2 細胞壁組分包被ELISA法檢測抗體水平41-42
• 3.3.3 流式細胞術(shù)檢測CD4+T和CD8+T細胞結(jié)果42-43
• 3.3.4 小鼠外周血細胞因子的檢測結(jié)果43-45
• 3.4 討論45-48
• 第四章 結(jié)論48-49
• 參考文獻49-56
• 致謝56-57
• 作者簡介57

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