本文關鍵詞：HBx-shRNA重組腺病毒的構建及功能鑒定

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【摘要】：目的:構建攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)標簽的乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)特異性shRNA重組腺病毒,并對其干擾效果進行鑒定。方法:將前期構建的真核表達載體pGenesil-1-HBx-shRNA和pGenesil-1-Scramble sequence的表達啟動子U6連同shRNA亞克隆到穿梭質粒pAdTrack-CMV,構建pAdTrack-CMV-U6-HBxshRNA和對照pAdTrack-CMV-U6-Scramble sequence穿梭質粒;酶切及DNA測序鑒定后,經(jīng)PmeⅠ線性化后轉化入感受態(tài)AdEasier細菌,獲得重組腺病毒質粒pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence,PacⅠ酶切后轉染AD293細胞獲得重組腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA和Ad-U6-Scramble sequence;擴增病毒,測定滴度;以RT-PCR和real-time PCR鑒定重組腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA對HBx的干擾效果。結果:酶切鑒定得到陽性pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence重組質粒;轉染到AD293細胞并包裝成功;RT-PCR以及real-time PCR表明,重組腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA攜帶的干擾片段能夠明顯干擾HBx表達(P=0.01)。結論:成功構建了HBx特異性shRNA重組腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA,它能抑制HepG2.2.15細胞中的HBx的表達,為研究HBx作為肝癌基因治療作用的一個靶點以及機制奠定基礎。
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院健康體檢部;重慶醫(yī)科大學教育部感染性疾病分子生物學重點實驗室;
【關鍵詞】： 重組腺病毒 乙型肝炎病毒X蛋白 shRNA 肝細胞肝癌
【基金】：重慶市渝中區(qū)軟科學研究資助項目(編號:20110213) 國家臨床重點專科護理建設資助項目(編號:財社【2010】305號)
【分類號】：R373
【正文快照】： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染被認為是導致肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要因素之一[1]。HBV X蛋白(hepatitis Bvirus X protein,HBx)是由HBV基因組編碼的17 kD蛋白,大量研究表明HBx與HCC的發(fā)生與發(fā)展有重要的聯(lián)系,因此對HBx的研究成為治療HCC

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