本文關(guān)鍵詞：腸道病毒71型2A蛋白在病毒復(fù)制能力與毒力中的作用

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【摘要】：腸道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)是手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)的主要病原體之一,屬于小RNA病毒(Picornaviridae)科,腸道病毒(Enterovirus) A屬(species A),具有嗜神經(jīng)性,主要感染嬰幼兒和五歲以下兒童。EV71感染造成的HFMD臨床癥狀呈現(xiàn)多樣化,一般僅表現(xiàn)為患者手、足、口部位的皮疹和皰疹等,為自限性疾病,但嚴重時可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)并發(fā)癥,包括脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、無菌性腦膜炎、腦干腦炎等,甚至造成死亡。EV71全長基因組約為7.4 kb,僅有一個開放閱讀框架(open reading fragment, ORF),兩端分別為3'UTR和5'UTR區(qū)。目前,EV71的致病機制仍不明確,我們之前的研究表明EV71的復(fù)制能力與病毒毒力相關(guān)。本研究利用反向遺傳技術(shù),將EV71山東分離株SDLY107株(分離自死亡患兒)與SDLY1株(分離自輕癥HFMD患兒)的2A蛋白進行置換后,構(gòu)建了具有感染性的嵌合病毒,研究2A蛋白在病毒復(fù)制能力和毒力中發(fā)揮的作用。目的：1.對EV71不同毒力表型株(SDLY 107株和SDLY1株)的2A進行置換,構(gòu)建出EV71嵌合體的感染性克隆cDNA,從而拯救出嵌合病毒株SDLY107-2A-1;2.研究原毒株和嵌合毒株在體外和體內(nèi)復(fù)制能力的差異,以期得到2A對病毒復(fù)制能力的影響；3.通過體外和體內(nèi)實驗研究原毒株和嵌合毒株對細胞和乳鼠器官損傷作用,以期得到2A對病毒毒力的影響。方法：1.利用重疊PCR的方法,設(shè)計合適的引物,獲得SDLY1株的2A基因片段,雙酶切后置換到含有SDLY 107株全長的質(zhì)粒pMD-19T中,利用體外轉(zhuǎn)錄獲得感染性RNA后,轉(zhuǎn)染至Vero細胞,觀察到明顯細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)后,盲傳三代,拯救出嵌合病毒SDLY 107-2A-1株；2.用EV71通用引物EV71-S和EV71-A擴增嵌合毒株的VP1片段,凝膠電泳進行鑒定；以SDLY 107株免疫ICR小鼠獲得的抗血清作為一抗,利用間接免疫熒光和免疫印跡等方法對嵌合病毒株進行鑒定,測序驗證后,用50%中點法和空斑試驗測定病毒滴度；3.將強毒株SDLY 107株、弱毒株SDLY1株及嵌合毒株SDLY 107-2A-1株分別感染細胞48 h后,利用LDH試驗和CCK-8試驗檢測不同毒株感染Vero細胞和RD細胞造成的細胞損傷差異；4.將強毒株SDLY 107株、弱毒株SDLY1株及嵌合毒株SDLY 107-2A-1株分別感染細胞,在不同溫度下(37℃和39℃)進行培養(yǎng),每12h取一次上清,連續(xù)取樣5 d,樣本統(tǒng)一凍存于-80℃。取樣完成后,提取病毒RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,利用實時熒光定量PCR (real time reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測病毒體外動力學曲線,比較不同毒株在體外的復(fù)制動力學差異；5.將一日齡ICR乳鼠分為8組,每組11只,實驗組乳鼠分別用SDLY 107株、SDLY1株、SDLY 107-2A-1株感染,每株病毒接種兩組,另設(shè)兩組對照組；另將一周齡ICR乳鼠分為5組,每組11只,將SDLY 107株、SDLY1株、SDLY107-2A-1株分別感染一組一周齡ICR乳鼠,另設(shè)一組對照組；感染途徑為腹腔注射,其中對照組用生理鹽水注射；每天觀察一日齡乳鼠感染組及對照組的臨床體征并記錄乳鼠體重；6.在感染后0 d-11 d連續(xù)采集乳鼠后肢肌肉組織,提取病毒RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,利用qRT-PCR檢測病毒在體內(nèi)復(fù)制曲線；在感染后1 d、5 d和9d采集乳鼠肺組織、腦組織、后肢肌肉組織和小腸組織,HE染色觀察乳鼠器官病變情況,免疫組化實驗檢測病毒抗原；結(jié)果：1.PCR、間接免疫熒光、免疫印跡及測序證明嵌合病毒拯救成功,且測出SDLY107株、SDLY 1株、SDLY 107-2A-1株滴度分別為2.22×105PFU/ml、 0.65×105PFU/ml、1.25×105PFU/ml;2.LDH實驗和CCK-8實驗表明嵌合毒株SDLY 107-2A-1株對細胞的損傷作用弱于強毒株SDLY 107株,強于弱毒株SDLY1株(P0.05)；3. qRT-PCR結(jié)果顯示嵌合毒株SDLY 107-2A-1株在體外37℃和39.5℃條件下復(fù)制能力均弱于強毒株SDLY 107株,強于弱毒株SDLY1株；嵌合毒株在乳鼠體內(nèi)復(fù)制能力弱于強毒株,強于弱毒株；4.HE病理染色情況和免疫組化實驗結(jié)果表明嵌合毒株對一日齡乳鼠器官造成的病理損傷介于強毒株和弱毒株之間；在乳鼠后肢肌肉組織中可檢測出嵌合毒株、強毒株及弱毒株的抗原,在腦組織中僅可檢測到嵌合毒株和強毒株的抗原。結(jié)論：1.成功拯救了嵌合體病毒SDLY 107-2A-1株,其產(chǎn)生的細胞病變效應(yīng)和親本病毒株SDLY 107株相似；2.EV71嵌合毒株和親本毒株在體內(nèi)外復(fù)制能力均有差異,表明2A蛋白在病毒復(fù)制能力過程中發(fā)揮作用,但2A蛋白并不是溫度敏感位點；3.EV71嵌合毒株和親本毒株對細胞和乳鼠器官組織的損傷作用均有差異,表明2A蛋白在病毒毒力中為關(guān)鍵蛋白；4.嵌合毒株和強毒株均可在腦中復(fù)制,但弱毒株在腦中沒有復(fù)制能力,這些結(jié)果說明2A蛋白并不能影響病毒侵入神經(jīng)系統(tǒng)和在腦內(nèi)復(fù)制的能力,這說明EV71是通過2A以外的機制侵入神經(jīng)系統(tǒng),這進一步說明了EV71的神經(jīng)毒力機制的復(fù)雜性。
【關(guān)鍵詞】：EV71 嵌合病毒 2A蛋白 病毒復(fù)制 毒力
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-16
• 前言16-22
• 材料和方法22-43
• 一、試劑22-30
• 二、儀器30-31
• 三、方法31-43
• 結(jié)果43-55
• 一、EV71毒株2A蛋白的氨基酸序列比對43
• 二、EV71嵌和病毒感染性克隆的構(gòu)建43-45
• 三、EV71嵌和病毒的拯救與鑒定45-48
• 四、EV71體外復(fù)制動力學48-49
• 五、EV71對細胞的損傷49-50
• 六、EV71對ICR乳鼠的組織病理損傷50-52
• 七、EV71在乳鼠體內(nèi)的分布52-53
• 八、EV71體內(nèi)復(fù)制動力學53-55
• 討論55-59
• 結(jié)論59-60
• 創(chuàng)新與不足之處60-61
• 附錄附圖61-63
• 參考文獻63-71
• 致謝71-72
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文及專利72-74
• 學位論文評閱及答辯情況表74

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1 于學東;姜濤;陳水平;鄧永強;韓劍峰;趙慧;李曉峰;劉然;于曼;秦成峰;秦鄂德;;登革4型病毒5′非編碼區(qū)SLB元件對病毒復(fù)制和翻譯的調(diào)控作用[J];解放軍醫(yī)學雜志;2008年07期

2 胡克勤,喻植群,李方和,張永源,郝連杰;乙型肝炎病毒前S蛋白檢測及其與病毒復(fù)制標志的關(guān)系[J];上海免疫學雜志;1989年06期

3 曾令蘭;熊開鈞;黃華芳;何生松;羅端德;王心禾;代家珠;劉紅艷;;乙型肝炎病毒持續(xù)感染患者細胞內(nèi)病毒復(fù)制的研究[J];病毒學雜志;1991年01期

4 ;快訊[J];生物工程學報;2010年04期

5 張陽根,胡雅遠,江先海;檢測PHSAR的固相血凝法[J];上海免疫學雜志;1991年01期

6 高飛;鄭浩;姜一峰;李麗薇;鄭海紅;周艷君;韋祖樟;童光志;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒5'非翻譯區(qū)一頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)是病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄必需的順式作用元件[J];中國動物傳染病學報;2014年04期

7 戴利成;王翠妮;何建方;錢佳平;王偉洪;施柏年;;血清乙肝病毒外膜大蛋白檢測及其與病毒復(fù)制的關(guān)系[J];中華實驗和臨床病毒學雜志;2006年03期

8 陳湖光;馬亦林;;流行性出血熱病毒致病作用的研究進展(綜述)[J];浙江醫(yī)科大學學報;1991年03期

9 朱艷萍;蔣建東;彭宗根;;APOBEC3G抑制病毒復(fù)制作用機制研究進展[J];藥學學報;2014年01期

10 祝婷;丁心平;萬延民;劉連興;彭虹;黃相剛;馮晏萌;鄔超;阮玉華;韓麗鳳;邢輝;王建軍;蘇斌;徐臣;徐建青;邵一鳴;;GBV-C/HIV共感染對AIDS疾病進程和HIV病毒復(fù)制的影響[J];病毒學報;2008年01期

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1 江玲;許智慧;劉妍;李曉東;姚偉明;李韋杰;戴久增;辛紹杰;徐東平;;HBV基因組A1846T變異對病毒復(fù)制力及核心啟動子活性的上調(diào)作用研究[A];第7屆全國疑難及重癥肝病大會論文集[C];2013年

2 戴煒;郭亞兵;楊大國;唐蔚;袁靜;王召欽;舒丹;;深圳地區(qū)HBV感染者病毒前C區(qū)變異與病毒復(fù)制水平關(guān)系[A];第九次全國中西醫(yī)結(jié)合肝病學術(shù)會議論文集[C];2000年

3 李艷梅;梁國棟;張仲凱;方榮祥;郝小江;;Glaucogenin C及其苷抑制正鏈RNA病毒復(fù)制活性及其作用機制研究[A];中國化學會第二十五屆學術(shù)年會論文摘要集（下冊）[C];2006年

4 許利軍;吳南屏;;CD38分子和HIV感染的關(guān)系[A];2005年浙江省感染病、肝病學術(shù)會議論文匯編[C];2005年

5 陸偉;張占卿;;血清β2-微球蛋白與慢性肝炎疾病程度和病毒復(fù)制之間的關(guān)系[A];中華醫(yī)學會全國第九次感染病學學術(shù)會議論文匯編[C];2006年

6 孫正偉;孫向陽;王威;董振芳;;乙型肝炎病毒基因分型與病毒復(fù)制的關(guān)系[A];第五屆全國肝臟疾病臨床暨中華肝臟病雜志成立十周年學術(shù)會議論文匯編[C];2006年

7 王強;汪光蓉;凡瞿明;何蘭;蔡艷娟;毛明;杜琴;張國元;;乙型肝炎病毒核酸相關(guān)抗原在評價病毒復(fù)制中的應(yīng)用價值[A];中華醫(yī)學會第九次全國檢驗醫(yī)學學術(shù)會議暨中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗管理專業(yè)委員會第六屆全國臨床檢驗實驗室管理學術(shù)會議論文匯編[C];2011年

8 江玲;許智慧;劉妍;辛紹杰;徐東平;;HBV基因組C1913A/G變異對病毒復(fù)制力影響及核心區(qū)融合蛋白pEGFP-Core-N1真核表達載體的構(gòu)建[A];第7屆全國疑難及重癥肝病大會論文集[C];2013年

9 宋煜;楊曉霞;王沛麗;程欣;韓陽;羅震;曹燕華;祝成亮;劉映樂;劉芳;鄔開朗;吳建國;;EV71激活的早期生長反應(yīng)蛋白1通過直接與病毒的5′非翻譯區(qū)結(jié)合從而促進病毒復(fù)制[A];2013年湖北省暨武漢微生物學會會員代表大會暨學術(shù)年會論文摘要集[C];2013年

10 黃利華;蔣躍明;童福易;曹立森;黃祖瑚;;HBVPreC/C變異對抗-HBc缺失和病毒復(fù)制的影響[A];中華醫(yī)學會第七次全國感染病學術(shù)會議論文匯編[C];2001年

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1 中證證券研究中心;重啤疫苗抑制病毒復(fù)制無顯著優(yōu)勢[N];中國證券報;2012年

2 毛磊;阻止非典病毒復(fù)制鼠可“自產(chǎn)”抗體[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2004年

3 唐風;美稱Rab9蛋白與病毒復(fù)制有關(guān)[N];中國醫(yī)藥報;2005年

4 方留民;硒的保健作用[N];中國食品質(zhì)量報;2001年

5 聞欣;Trim5-α可抑制HIV復(fù)制[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2004年

6 記者 江南;中歐非典研究獲重大進展[N];人民日報海外版;2005年

7 劉彬;乙肝需要復(fù)查的化驗項目有哪些[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2005年

8 張濤 譯;老藥沖鋒在前沿[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2002年

9 毛文波;可抑制艾滋病病毒復(fù)制的特效分子問世[N];科技日報;2007年

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1 鄧萍;蕪菁花葉病毒CI蛋白參與病毒復(fù)制和運動及其與寄主的相互作用研究[D];福建農(nóng)林大學;2015年

2 張禮洲;VP2互作蛋白CK1α及CSGalNAcT2在雞傳染性法氏囊病病毒復(fù)制中的作用及分子機制研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2016年

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1 王環(huán)茹;P小體相關(guān)蛋白MOV10結(jié)合于EV71基因組5’UTR并調(diào)控病毒復(fù)制[D];南京大學;2016年

2 董春艷;miR-9與MCPIP1互作對流感病毒復(fù)制的影響[D];吉林大學;2016年

3 喬喬;腸道病毒71型2A蛋白在病毒復(fù)制能力與毒力中的作用[D];山東大學;2016年

4 李瀅;慢性乙型肝炎病毒感染病毒復(fù)制與肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)性的初步探討[D];遵義醫(yī)學院;2013年

5 李亮亮;豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5與細胞凋亡和病毒復(fù)制關(guān)系的初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2014年

6 賈麗潔;ICP27特異性siRNA抑制HSV-1病毒復(fù)制的實驗研究[D];鄭州大學;2010年

7 李治;抑癌基因Arid2對HBV病毒復(fù)制的調(diào)控及分子機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

8 張馳;天然免疫分子Tetherin的克隆、表達及對流感病毒復(fù)制的影響[D];汕頭大學;2011年

9 于毅;強的松對HBV感染小鼠體內(nèi)病毒復(fù)制影響的實驗研究[D];川北醫(yī)學院;2013年

10 田小星;HMGB1在HBV復(fù)制中的作用研究[D];重慶醫(yī)科大學;2012年

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