本文關鍵詞：部分結扎頸總動脈誘導ApoE基因敲除大鼠動脈粥樣硬化模型及mTOR的相關性分析

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【摘要】：研究背景和目的:目前,ApoE~(-/-)小鼠是已成功建立的較好的研究動脈粥樣硬化的模型動物,然而其牽涉各動脈分支的動脈粥樣硬化斑塊分布以及斑塊內(nèi)組成成分與動脈粥樣硬化病人有很大程度的不同。并且,考慮到其較小的體型,并不適合血管內(nèi)成形術、試驗新型藥物支架或者新型醫(yī)療裝置。雖然類如小型豬、犬類等大型動物當前也應用于血管移植方面的研究,但其價格也是不菲的。大鼠在研究心血管疾病方面,特別是高血壓及腦卒中,是優(yōu)秀而且適合的模型動物。相對于小鼠,大鼠的生理狀況也更容易檢測,也更類似于相應的人類情況,其大小也更適合血管內(nèi)介入的操作。但目前為止,并沒有適合動脈粥樣硬化的大鼠模型。雖然前期不同的研究團隊都嘗試著用不同的誘導方法,去建立動脈粥樣硬化模型,但這些結果仍然是不確定的。飲食誘導的高膽固醇血癥并不能誘發(fā)大鼠的動脈粥樣硬化,因此普遍認為大鼠具有對高脂的抵抗性,另一個可能的原因則為高脂誘導的高膽固醇血癥,其血膽固醇水平仍不足以引起動脈粥樣硬化。因此,我們嘗試通過轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技術,構建Apo E基因敲除大鼠,給予高膽固醇飲食,誘發(fā)其極高水平的高膽固醇血癥,再采用部分結扎頸總動脈的手術方式造成紊亂的血流剪切力,導致血管內(nèi)皮損傷,從而建立大鼠動脈粥樣硬化模型并進行評價。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)控平滑肌細胞增殖的關鍵分子,而近年來平滑肌細胞增殖被認為在動脈粥樣硬化的發(fā)生和演變中均有重要作用,我們前期研究也發(fā)現(xiàn)mTOR的表達與小鼠動脈粥樣硬化斑塊的負荷具有相關性。因此,在本研究中擬進一步探討冠心病患者外周血淋巴細胞mTOR的表達水平與冠脈狹窄程度的相關性。研究方法:研究分為兩部分第一部分:ApoE~(-/-)大鼠動脈粥樣硬化模型建立及評價1.實驗動物及ApoE~(-/-)大鼠的構建雄性SD大鼠作為實驗對照組,采用TALENs技術以SD大鼠為遺傳背景構建Apo E敲除大鼠,所有實驗動物均SPF環(huán)境培養(yǎng),自由取食及飲水。2.高膽固醇飲食飼養(yǎng)將6-8周齡大小雄性SD野生型及ApoE~(-/-)大鼠隨機分為普通飲食及高膽固醇飲食四組,高膽固醇飲食成分為67.8%基礎飼料,10%豬油,1.5%膽固醇,0.5%膽酸鈉,15%蛋黃粉,0.2%甲硫氧嘧啶,以及1.5%蔗糖。3.ApoE~(-/-)大鼠生理情況測量經(jīng)過普通及高膽固醇飲食飼養(yǎng)12周后,測量每組體重、隨機血糖、心率、動脈血壓。4.血脂及血清炎性因子的測量檢測其血清TG水平、TC水平、LDL-c水平、HDL-c水平,ELISA檢測其腫瘤壞死因子a、白介素1b、白介素6、白介素10水平。5.主動脈大體油紅染色6.部分結扎左側頸總動脈將6-8周齡大小雄性WT及ApoE~(-/-)大鼠經(jīng)過高膽固醇飲食處理10周后,部分結扎左側頸總動脈,右側頸總動脈作為對照,繼續(xù)高膽固醇飲食兩周后取材。7.組織病理分析主動脈根部及雙側頸總動脈進行油紅O染色、HE染色、MASSON染色,雙側頸總動脈進行免疫熒光染色(CD31、CD68、a-SMA),以及TUNEL染色。8.實時熒光定量PCR1)檢測主動脈MCP-1、VCAM-1的mRNA表達情況2)檢測頸總動脈MCP-1、VCAM-1、mTOR的mRNA表達情況第二部分:外周血淋巴細胞mTOR mRNA水平與冠心病患者冠脈病變程度的相關性分析1.收集臨床冠脈造影陽性及陰性結果患者病例資料2.檢測外周血淋巴細胞mTOR mRNA表達情況3.進行相關臨床指標及mTOR與冠狀動脈病變程度的相關性分析結果:1.成功構建ApoE~(-/-)大鼠運用TALENs技術成功構建以SD大鼠為遺產(chǎn)背景的ApoE~(-/-)大鼠,基因組DNA測序結果顯示其相對于野生型大鼠,于Apo E基因核心編碼區(qū)缺失14個堿基對。2.ApoE~(-/-)大鼠生理情況普通飲食下ApoE~(-/-)大鼠和野生型大鼠體重無明顯差異,但高膽固醇飲食喂養(yǎng)12周后,兩種基因型大鼠體重均出現(xiàn)顯著的降低(P0.05),而且高膽固醇飲食均造成ApoE~(-/-)大鼠與野生型大鼠隨機血糖輕微的上升(P0.05)。ApoE~(-/-)大鼠相比野生型大鼠心率血壓并無明顯變化,說明Apo E基因缺陷并未對心率血壓造成影響,但是高膽固醇飲食卻導致了ApoE~(-/-)大鼠和野生型大鼠心率血壓不同程度的下降(P0.05)。同既往的研究類似,高膽固醇飲食僅僅造成了野生型大鼠TG及LDL-c輕微幅度的升高(P0.01),但卻促成了ApoE~(-/-)大鼠極其顯著的上升(P0.01),形成了典型的血脂紊亂。3.ApoE~(-/-)大鼠對高膽固醇血癥的抵抗性四組大鼠主動脈大體油紅染色均呈陰性結果,同時,主動脈根部HE染色也未發(fā)現(xiàn)明顯的動脈粥樣硬化斑塊形成。進一步探究原因,四組大鼠ELISA檢測血清TNF-a、IL-1b、IL-6水平并沒有明顯的較大差異,實時熒光定量PCR結果顯示高膽固醇飲食喂養(yǎng)的ApoE~(-/-)大鼠主動脈MCP-1、VCAM-1也僅僅是呈數(shù)倍的升高(P0.05)。4.部分結扎左側頸總動脈誘導動脈粥樣硬化高膽固醇飲食背景下,部分結扎左側頸總動脈兩周后的ApoE~(-/-)大鼠及野生型大鼠HE染色均顯示出大小面積相似的斑塊形成,MASSON染色結果均提示有少量纖維素沉積,但ORO染色結果顯示ApoE~(-/-)大鼠斑塊內(nèi)陽性,而野生型大鼠則為陰性。免疫熒光染色結果顯示ApoE~(-/-)大鼠斑塊內(nèi)富集大量的CD68陽性巨噬細胞,相比之下,野生型大鼠斑塊內(nèi)則顯示富集大量平滑肌細胞而無CD68陽性巨噬細胞,另外,ApoE~(-/-)大鼠斑塊內(nèi)有CD31陽性的新生血管出現(xiàn),而野生型大鼠則未發(fā)現(xiàn)明顯CD31陽性結果。實時熒光定量PCR結果顯示,兩種基因型大鼠與正常右側頸總動脈相比,結扎側的頸總動脈MCP-1、VCAM-1、mTOR均有顯著升高(P0.01)。5.兩組患者臨床指標的比較冠狀動脈病變組的年齡、BMI、TG、TC、LDL-c、Gensini積分與冠狀動脈正常組相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而其他因素如性別、民族、心率、血壓、空腹血糖、FFA、ALT、AST、Scr、BUN、UA、HDL-c、Apo A、Apo B、LPA則差異無明顯統(tǒng)計學意義。6.各臨床指標及mTOR mRNA水平及與冠脈狹窄程度的相關分析全部患者TG、TC、年齡及外周血淋巴細胞mTOR表達水平均與冠狀動脈病變的Gensini積分成正相關,相關系數(shù)r分別為0.254、0.236、0.207、0.343,P值均0.01,而LDL、BMI則與冠脈狹窄程度無明顯相關性。結論:ApoE~(-/-)大鼠可成為高膽固醇血癥新型模型,通過部分結扎左側頸總動脈可建立動脈粥樣硬化模型,其mTOR表達水平顯著升高,臨床回歸性研究可驗證患者外周血淋巴細胞mTOR表達水平均與冠脈狹窄程度呈正相關。
【關鍵詞】：TALENs ApoE~(-/-)大鼠 動脈粥樣硬化 mTOR
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5;R-332
【目錄】：

• 英文縮略語表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 ApoE~(-/-)大鼠動脈粥樣硬化模型建立及評價16-48
• 2.1 實驗材料16-20
• 2.2 實驗方法20-28
• 2.3 結果28-44
• 2.4 討論44-48
• 第三章 外周血淋巴細胞mTOR mRNA水平與冠心病患者冠脈病變程度的相關性分析48-55
• 3.1 實驗材料48-49
• 3.2 實驗方法49-52
• 3.3 結果52-54
• 3.4 討論54-55
• 全文結論55-56
• 參考文獻56-59
• 文獻綜述 基因工程動脈粥樣硬化動物模型研究進展59-66
• 參考文獻63-66
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文66-67
• 致謝67

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1 陳同度,張昌穎;素食大鼠的貧血現(xiàn)象[J];營養(yǎng)學報;1957年04期

2 陳偉強;趙善廣;;自制注射用大鼠固定裝置[J];上海實驗動物科學;1992年04期

3 肖柳英,林培英,馮昭明,張丹;不同周齡的SD大鼠生理、生化及體重的正常值測定[J];中藥新藥與臨床藥理;1996年03期

4 李淑云;簡易大鼠灌胃器的制作[J];錦州醫(yī)學院學報;2001年04期

5 楊明智,陳積圣;一種大鼠抓取與固定的新工具介紹[J];上海實驗動物科學;2001年03期

6 戴英,陸群;復方H_(505)對Wistar大鼠外周血的血液流變學指標的影響[J];中國血液流變學雜志;2001年01期

7 韋應波,孫喜慶,曹新生,姚永杰,馮岱雅,楊長斌;+Gz暴露時間對大鼠記憶功能和行為的影響[J];航天醫(yī)學與醫(yī)學工程;2003年01期

8 呂學軍,郭俊生,李敏,周利梅,張永娟;暈船大鼠體內(nèi)鐵含量的變化[J];中國職業(yè)醫(yī)學;2003年04期

9 湯仁仙,王迎偉,王慧,周峰;201A中藥合劑對大鼠抗腎小球基底膜腎炎病變的影響[J];徐州醫(yī)學院學報;2003年06期

10 孫同柱,付小兵,翁立新,梁雪梅,陳偉;介紹一種簡易的大鼠保定方法[J];上海實驗動物科學;2004年01期

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1 尹音;孫振宇;胡敏;李冬霞;;持續(xù)性高正加速度對大鼠顳頜關節(jié)損傷的作用[A];第八屆全國顳下頜關節(jié)病學及（牙合）學大會論文匯編[C];2011年

2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;，

本文編號：511999