本文關鍵詞：Fancd2os基因在小鼠不同組織中的表達譜分析及其真核表達載體的構建與鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:哺乳動物的精子發(fā)生是極其復雜而精細的過程,是睪丸組織各類細胞與細胞內外環(huán)境相互作用的結果,其中睪丸組織特異表達或者高表達基因可能起著關鍵性的作用。本研究在課題組前期工作基礎上,通過生物信息學方法分析Fancd2os基因及其編碼蛋白的基本性質;隨后應用分子生物學基本技術從m RNA和蛋白質水平分析Fancd2os基因在小鼠不同的組織和不同發(fā)育階段的睪丸組織中的表達,利用組織化學染色技術對Fancd2os蛋白進行細胞定位;并構建Fancd2os基因的真核表達載體初步探討其可能的生物學作用,為深入研究Fancd2os基因的功能奠定基礎。方法:1、利用生物信息學軟件和相關數(shù)據(jù)庫對Fancd2os基因及其編碼蛋白質進行結構分析和功能預測,包括同源性、進化樹、蛋白質理化性質、跨膜區(qū)、親疏水性、信號肽、亞細胞定位、翻譯后修飾位點、磷酸化位點、抗原表位位點、蛋白質二級結構、相互作用、電子表達譜以及GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫等分析和預測。2、應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測Fancd2os m RNA在小鼠七種組織的表達情況。3、應用免疫印跡(Western blotting)技術分析Fancd2os蛋白在小鼠七種組織中的表達水平。4、利用實時定量PCR(real-time PCR)分析Fancd2os m RNA在不同發(fā)育階段的睪丸組織中的表達。5、應用免疫印跡(Western blotting)技術分析Fancd2os蛋白在不同發(fā)育階段的睪丸組織中的表達。6、通過免疫組織化學染色檢測Fancd2os蛋白在小鼠睪丸組織中的細胞定位。7、利用分子克隆技術構建Fancd2os基因的真核表達載體p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os,并進行鑒定。8、將重組質粒通過脂質體介導轉染HEK293T細胞,并分別采用反轉錄PCR和Western blotting檢測Fancd2os基因的表達情況。結果:1、生物信息學分析提示Fancd2os基因位于小鼠6號染色體E3部分,c DNA全長為1358bp,開放閱讀框包含536個核苷酸,編碼產生含178個氨基酸的蛋白質產物,酸性氨基酸13個,堿性氨基酸23個,理論等電點為9.56,不穩(wěn)定系數(shù)為51.95;小鼠Fancd2os蛋白的氨基酸序列與大鼠、牛、人的相似性分別為97.8%、93.3%、92.1%;蛋白質二級結構預測表明該蛋白質含有55.62%的無規(guī)則卷曲,30.34%的α螺旋;應用PSORT預測Fancd2os蛋白定位在細胞漿可能性最大,預測值為45%,該蛋白無信號肽序列和跨膜序列,為親水性蛋白;磷酸化位點分析預測Fancd2os蛋白質存在8個色氨酸磷酸化位點和5個蘇氨酸磷酸化位點,采用Motif Scan預測結果提示Fancd2os蛋白含有10個翻譯后修飾位點,分別是1個c AMP磷酸化位點、3個CKⅡ磷酸化位點和6個PKC磷酸化位點;EST電子表達譜顯示Fancd2os基因主要在睪丸組織中表達,腎臟組織微弱表達;GEO數(shù)據(jù)庫分析結果提示Fancd2os基因的表達可能與線粒體Clp P蛋白酶的表達密切相關;MGI Interaction Explorer數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)Fancd2os基因與95個mi RNA具有相互作用。2、半定量RT-PCR分析表明Fancd2os基因在睪丸組織中的表達非常顯著,腎臟組織表達微弱,其它他組織未檢測到表達條帶。3、Western blotting結果表明該蛋白主要表達于睪丸組織,腎臟也有微弱表達,其它組織未見明顯陽性條帶。4、實時定量PCR檢測結果表明Fancd2os基因在不同周齡的小鼠睪丸組織中具有顯著的階段特異性表達特征,以8周齡小鼠表達水平最高。5、Western blotting結果顯示Fancd2os蛋白在不同周齡的小鼠睪丸組織中具有明顯的階段特異性,以8周齡小鼠表達水平最高。6、免疫組織化學染色顯示Fancd2os蛋白在睪丸曲細精管中定位主要集中在精母細胞和圓形精子細胞的胞質中。7、PCR、雙酶切圖譜和DNA測序結果均顯示Fancd2os基因真核表達載p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os構建成功。8、反轉錄PCR和Western blotting結果表明p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os重組質粒轉染HEK293T細胞后,Fancd2os基因可以表達其蛋白產物。結論:Fancd2os基因及其編碼蛋白在小鼠多種組織中具有顯著的差異表達,為睪丸組織高表達基因,并且其m RNA及蛋白的表達水平隨著小鼠睪丸的發(fā)育過程呈上調趨勢。結合生物信息學分析結果,推測Fancd2os基因可能與睪丸組織的發(fā)育及精子發(fā)生過程有關,利用本研究成功構建的Fancd2os基因真核表達載體可以進一步在細胞水平探討該基因的功能,尤其是在精子發(fā)生中的具體作用。
【關鍵詞】：Fancd2os 生物信息學 睪丸組織 精子發(fā)生
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R321
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 常用縮寫詞中英文對照表11-13
• 前言13-15
• 1 材料與方法15-31
• 1.1 實驗材料15-20
• 1.2 研究方法20-31
• 2 結果31-49
• 2.1 Fancd2os基因及編碼蛋白的生物信息學分析31-40
• 2.2 Fancd2os基因的組織特異性表達40-41
• 2.3 Fancd2os基因在小鼠睪丸組織的階段特異性表達41-43
• 2.4 Fancd2os蛋白在小鼠睪丸組織中的細胞定位43-45
• 2.5 Fancd2os基因重組質粒的構建與鑒定45-47
• 2.6 重組質粒在HEK293T細胞中的表達47-49
• 3 討論49-53
• 4 結論53-54
• 參考文獻54-57
• 綜述57-72
• 參考文獻67-72
• 致謝72-73
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果73-74
• 個人簡歷74

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 景花;宋沁馨;周國華;;MicroRNA定量檢測方法的研究進展[J];遺傳;2010年01期

2 冉茂良;陳斌;尹杰;楊岸奇;蔣明;;睪丸發(fā)育和精子生成相關miRNA研究進展[J];遺傳;2014年07期

  本文關鍵詞：Fancd2os基因在小鼠不同組織中的表達譜分析及其真核表達載體的構建與鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：407679