本文關(guān)鍵詞：β1整合素的表達(dá)純化及在篩查幽門(mén)螺桿菌與之結(jié)合蛋白中的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)近年來(lái)被認(rèn)為是一種兼性胞內(nèi)菌,它不僅能侵入細(xì)胞,而且可在細(xì)胞內(nèi)繁殖和產(chǎn)生毒素。已有研究證實(shí),Hp可通過(guò)細(xì)胞表面的β1整合素介導(dǎo)而侵入胃上皮細(xì)胞,但與此相關(guān)的細(xì)菌蛋白及其相應(yīng)作用目前尚不清楚。本課題旨在通過(guò)原核表達(dá)純化技術(shù),獲得可溶性的β1整合素蛋白。將制備好的β1整合素蛋白和本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的Hp T7噬菌體展示c DNA文庫(kù)親和淘洗篩選,獲得與β1整合素相互作用的Hp蛋白DNA序列,為下一步研究和β1整合素相互作用的蛋白以及相關(guān)功能奠定基礎(chǔ)。方法①?gòu)腉ENBANK獲得β1整合素CDS區(qū)序列,保留β1整合素的胞外膜區(qū),截掉β1整合素的N端信號(hào)肽序列。②分析β1整合素的稀有密碼子分布情況,優(yōu)化β1整合素的稀有密碼子。參照β1整合素的m RNA二級(jí)結(jié)構(gòu),優(yōu)化TIR的密碼子。③全基因合成β1整合素序列并插入到克隆載體p UC18。分別將p UC18-β1-integrin質(zhì)粒和p ET30a載體雙酶切,回收后的片段使用T4連接酶連接。④p ET30a-β1-integrin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài),挑取陽(yáng)性單克隆誘導(dǎo)表達(dá)并SDS-PAGE電泳分析其表達(dá)情況。⑤取保存的菌株誘導(dǎo)后超聲破菌收集上清,SDS-PAGE電泳分析蛋白的可溶性。⑥誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)并收集包涵體,包涵體破碎和溶解后過(guò)Ni-NTA柱,用含不同濃度的咪唑洗脫液洗脫,收集各個(gè)濃度的洗脫液并SDS-PAGE電泳分析。⑦將溶解的蛋白裝入透析袋,先以復(fù)性液透析三次,再以蛋白貯存液透析三次,濾膜過(guò)濾后于冰箱凍存。⑧使用純化的β1整合素篩查Hp T7噬菌體展示c DNA文庫(kù)。挑取單個(gè)噬菌斑進(jìn)行PCR反應(yīng),瓊脂糖電泳檢查PCR反應(yīng)產(chǎn)物并回收,T7特異性引物進(jìn)行測(cè)序分析。⑨將獲得的序列在NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列比較。結(jié)果①全基因合成的p UC18-β1-integrin質(zhì)粒單酶切鑒定結(jié)果正確。②構(gòu)建好的p ET30a-β1-integrin質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果正確。③p ET30a-β1-integrin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后挑取單克隆誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE結(jié)果得出在β1整合素分子量80k D附近有條帶。④SDS-PAGE分析蛋白可溶性得出,β1整合素在上清表達(dá)量很低,大部分以包涵體形式表達(dá)。⑤通過(guò)包涵體變性和復(fù)性得到可溶的β1整合素蛋白,其濃度為0.32mg/ml。Western blot使用his-tag抗體檢測(cè)目的蛋白,在其分子量80k D附近有條帶。SDS-PAGE檢測(cè)純化好的蛋白,在其分子量80k D附近有單一條帶。蛋白凍融實(shí)驗(yàn)得出目的蛋白凍融后無(wú)懸浮物,離心后無(wú)明顯沉淀。⑥Hp T7噬菌體展示c DNA文庫(kù)篩選與β1整合素互相結(jié)合的蛋白,測(cè)序比對(duì)后得到2個(gè)與β1整合素結(jié)合的預(yù)選蛋白。結(jié)論①通過(guò)原核表達(dá)、純化技術(shù),獲得可溶性、純度較高的β1整合素蛋白。②Hp T7噬菌體展示c DNA文庫(kù)篩選與β1整合素互相結(jié)合的蛋白,得到2個(gè)和β1整合素結(jié)合的預(yù)選蛋白。
【關(guān)鍵詞】：幽門(mén)螺桿菌 β1整合素 原核表達(dá) 純化 親和淘洗篩選
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 英文縮略語(yǔ)表4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-13
• 材料和方法13-25
• 結(jié)果25-34
• 討論34-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻(xiàn)39-41
• 綜述41-48
• 參考文獻(xiàn)44-48
• 致謝48

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 葉方寅;信號(hào)肽假說(shuō)的提出及證實(shí)——1999年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者Günter Blobel簡(jiǎn)介[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));1999年06期

2 龍建銀,王會(huì)信;外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的研究進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1997年02期

3 徐萬(wàn)祥,邱德義,熊艷,申慶祥,顧少華,曹根濤,應(yīng)康,謝毅;去N端信號(hào)肽和C端跨膜區(qū)豬卵透明帶-3β蛋白在原核系統(tǒng)表達(dá)的研究[J];生物工程學(xué)報(bào);2001年01期

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  本文關(guān)鍵詞：β1整合素的表達(dá)純化及在篩查幽門(mén)螺桿菌與之結(jié)合蛋白中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：406431