目的純化白色念株菌(Candida albicans)谷氧還蛋白(glutaredoxin,Grx)并制備多克隆抗體。方法從NCBI網(wǎng)站搜索白色念株菌Grx蛋白序列,采用利用生物信息學(xué)方法分析其生物學(xué)特性。以白色念珠菌DNA為模板,PCR擴(kuò)增Grx基因,雙切后與質(zhì)粒pET28a相連,連接產(chǎn)物pET28a-Grx轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21(DE3),使用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),使用親和層析純化目的蛋白。用Grx蛋白免疫小鼠,制備抗血清,進(jìn)行Western blot和ELISA檢測(cè)。結(jié)果白色念珠菌Grx蛋白含有一個(gè)CXXC結(jié)構(gòu)域,屬跨膜蛋白。其二級(jí)結(jié)構(gòu)中58.8%的氨基酸為α-螺旋,12.6%為β片層,23.5%為無(wú)規(guī)卷曲,三級(jí)結(jié)構(gòu)與酵母Grx蛋白結(jié)構(gòu)相似。Grx蛋白具有多個(gè)B細(xì)胞表位。獲得Grx基因并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-Grx,轉(zhuǎn)染DE3后表達(dá)15.2×103的重組蛋白。用純化的重組Grx蛋白免疫小鼠,獲得的多克隆抗體ELISA效價(jià)為1:10 240。結(jié)論成功表達(dá)白色念株菌Grx蛋白并制備了高滴度的多克隆抗體,為Grx的活性研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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圖1白色念珠菌Grx蛋白與大腸埃希菌、酵母和擬南芥Grx蛋白的同源性分析（框內(nèi)為CXXC活性中心）

將白色念株菌的Grx蛋白與大腸埃希菌（E.coli），酵母（S.cerevisiae）和擬南芥（A.thaliana）的Grx蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析，其中與酵母Grx蛋白的同源性較高，為51.9%。Grx蛋白的CXXC活性中心高度保守，白色念珠菌的Grx蛋白CXXC結(jié)構(gòu)域位于該蛋白....

圖2白色念株Grx蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域

SignalIP5.0預(yù)測(cè)白色念株菌Grx無(wú)信號(hào)肽，TMPRED軟件預(yù)測(cè)該蛋白的5-26位氨基酸為跨膜區(qū)（圖2）。利用SOPMA軟件分析Grx蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，其58.8%的氨基酸為α-螺旋，12.6%為β片層，23.5%為無(wú)規(guī)卷曲（圖3）。

圖3白色念珠菌Grx蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

利用SOPMA軟件分析Grx蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，其58.8%的氨基酸為α-螺旋，12.6%為β片層，23.5%為無(wú)規(guī)卷曲（圖3）。利用酵母的Grx蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（3ctg.1.A）為模板，登陸SwissModel網(wǎng)站模擬得到白色念株菌Grx蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4白色念珠菌Grx蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

利用酵母的Grx蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（3ctg.1.A）為模板，登陸SwissModel網(wǎng)站模擬得到白色念株菌Grx蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖4。利用iedb網(wǎng)站預(yù)測(cè)Grx蛋白的B細(xì)胞表位，結(jié)果見(jiàn)圖5。Grx蛋白有4個(gè)可能的B細(xì)胞表位。B細(xì)胞表位的氨基酸酸組成及位置見(jiàn)表1。

本文編號(hào)：3992180