目的:通過原位礦化的方式制備肺炎鏈球菌蛋白質(zhì)的磷酸鈣礦化顆粒,并評價(jià)其在蛋白酶和熱處理后的穩(wěn)定性。方法:通過分子克隆技術(shù)表達(dá)并純化蛋白野生型溶血素(WT-PLY)和其無溶血活性突變體(ΔA146PLY),在富含Ca²⁺和PO₄^3-的弱堿性溶液(pH=7.5)中進(jìn)行生物礦化,制備磷酸鈣礦化的蛋白顆粒;通過TEM、FESEM、EDS等分析礦化顆粒的大小、形貌及表面成分;通過抗蛋白酶K降解實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)等分析礦化疫苗的穩(wěn)定性;通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)評估熱處理后礦化蛋白疫苗的保護(hù)效應(yīng)。結(jié)果:在1 ml礦化體系中含有360μg蛋白、8.8μmol Ca²⁺、8.8μmol Mg²⁺和5.28μmol PO₄^3-的條件下,均可制備出WT-PLY和ΔA146PLY的礦化顆粒,BCA檢測其包封率分別為44.4%和52.2%;礦化顆粒WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP在蛋白酶K處理15 min內(nèi)其抗酶解活性高于其可溶性蛋白;礦化顆粒...

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圖4WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP的FESEM圖

圖3WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP的TEM圖2.3.2FESEM

圖1蛋白WT-PLY和ΔA146PLY原核表達(dá)、純化后SDS-PAGE分析

礦化結(jié)果顯示:蛋白礦化后呈懸濁液,與蛋白溶液相比,呈現(xiàn)比較明顯的半透明狀(圖2A、D)。分離礦化液上清和沉淀,進(jìn)行SDS-PAGE,灰度分析結(jié)果顯示W(wǎng)T-PLY@CaP上清中蛋白含量為51.3%,沉淀中為40.6%;ΔA146PLY@CaP蛋白含量為51.6%,沉淀中為44.7%....

圖2礦化后蛋白納米顆粒的表達(dá)效果及SDS-PAGE、BCA結(jié)果

圖1蛋白WT-PLY和ΔA146PLY原核表達(dá)、純化后SDS-PAGE分析2.3礦化納米顆粒的生物表征

圖9礦化蛋白熱處理后小鼠的免疫保護(hù)效應(yīng)

圖8不同溫度處理ΔA146PLY和ΔA146PLY@CaP后刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-6和TNF-α2.4.2溶血實(shí)驗(yàn)

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