目的淋巴細(xì)胞激活基因3(LAG-3)是一個(gè)極具潛力的腫瘤治療靶點(diǎn)。本研究旨在從大容量全人源噬菌體抗體庫(kù)中篩選抗LAG-3的單鏈抗體(scFv),將其轉(zhuǎn)化為完整的全人源抗體。方法從全人源噬菌體抗體庫(kù),篩選抗LAG-3全人源噬菌體scFv,ELISA鑒定噬菌體scFv的特異性,采用表面等離子共振技術(shù)(SPR)測(cè)定其親和力,再通過真核表達(dá)系統(tǒng)獲得抗LAG-3全人源完整抗體。結(jié)果通過3輪篩選富集,獲得了4個(gè)具有特異結(jié)合活性的scFv。親和力測(cè)定最高的達(dá)到3.48×10^-10。再通過構(gòu)建完整的抗LAG-3全人源抗體表達(dá)載體,經(jīng)真核細(xì)胞表達(dá)、純化后,獲得了3株特異性抗LAG-3全人源抗體。結(jié)論利用大容量全人源噬菌體抗體庫(kù),成功篩選并表達(dá)出3種高親和力和特異性的抗LAG-3全人源抗體。

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圖1ELISA篩選抗LAG-3噬菌體scFv

表1抗LAG-3噬菌體scFv各輪篩選情況篩選輪次投入量產(chǎn)出量回收率12.00×10136.97×1053.49×10-824.95×10124.20×1058.48×10-836.02×10121.25×1062.08×10-7注釋:回收率=....

圖2ELISA鑒定抗LAG-3噬菌體scFv的特異性

圖1ELISA篩選抗LAG-3噬菌體scFv2.2抗LAG-3噬菌體scFv可變區(qū)基因序列分析

圖3抗人LAG-3-scFv輕重鏈可變區(qū)擴(kuò)增電泳圖

采用普通PCR技術(shù)擴(kuò)增輕重鏈可變區(qū),采用10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物,條帶大小在350bp左右(圖3)。隨后,構(gòu)建重組載體,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,隨機(jī)挑取單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。小量提取質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切反應(yīng),經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖....

圖4抗LAG-3完整真核表達(dá)載體雙酶切電泳圖

圖3抗人LAG-3-scFv輕重鏈可變區(qū)擴(kuò)增電泳圖2.5SDS-PAGE鑒定抗LAG-3完整人源抗體分離純化

本文編號(hào)：3934201