埃博拉病毒病(EVD)是由絲狀病毒科埃博拉病毒(EBOV)感染人類和非靈長類動物導致的致命性傳染性出血性疾病,病死率高。盡管目前針對EVD的研究和治療取得顯著進步,但EBOV在宿主細胞內的生命周期相關分子機制等仍不明確,可用于EVD患者的有效治療仍非常有限。本研究擬在2級生物安全實驗室環(huán)境下,構建具備復制和轉錄基本功能的埃博拉病毒樣顆粒(EBOV-trVLPs),合成靶向與RNA病毒生命周期(病毒入侵、脫殼、融合、復制、裝配及出芽等)密切相關的宿主siRNAs,通過RNA干擾(RNAi)來篩選對EBOV-trVLPs復制產生重要影響的宿主蛋白,并驗證宿主蛋白與EBOV-trVLPs GP、VP40蛋白及核酸的相互作用關系。通過雜交瘤技術合成抗EBOVGP和VP40單克隆抗體(mAb),開展體外抗EBOVGP和VP40 mAb單用及聯(lián)合應用針對EBOV-trVLPs的抗病毒效應研究。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)宿主分子伴侶、膜轉運蛋白和信號轉導蛋白等與EBOV-trVLPs生命周期密切相關,并與trVLPs的GP、VP40蛋白及核酸發(fā)生相互作用;證實抗GP和抗VP40 mAb的聯(lián)合、抗VP40 ...

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【學位級別】：博士

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縮略詞表
第一部分 埃博拉病毒樣顆粒體外復制系統(tǒng)的建立
    1.1 背景
    1.2 材料和方法
        1.2.1 主要實驗試劑和耗材
        1.2.2 細胞系和質粒
        1.2.3 質粒擴增、抽提與鑒定
        1.2.4 trVLPs的構建
        1.2.5 電鏡觀察trVLPs
        1.2.6 DiI標記的trVLPs入侵活細胞過程觀察
        1.2.7 trVLPs的半數(shù)培養(yǎng)組織感染劑量(50% Tissue Culture Infective Dose,TCID50)測定
    1.3 實驗結果
        1.3.1 EBOV-trVLPs模型能在體外細胞實驗中穩(wěn)定復制表達
        1.3.2 EBOV-trVLPs能在2級生物安全實驗室從大小和形態(tài)學上模擬EBOV野毒株
        1.3.3 DiI-trVLPs入侵活細胞過程示蹤
    1.4 討論
    1.5 參考文獻
第二部分 EBOV-trVLPs生命周期相關重要宿主因子的篩選及相互作用的研究
    2.1 背景
    2.2 材料和方法
        2.2.1 主要實驗試劑和耗材
        2.2.2 細胞系和質粒
        2.2.3 SiRNAs庫的建立
        2.2.4 SiRNAs篩選流程
        2.2.5 RNAi與trVLPs感染
        2.2.6 RNA抽提及RT-PCR檢測siRNAs敲減后細胞內trVLPs -RNA水平
        2.2.7 候選宿主蛋白抗體
        2.2.8 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)及蛋白免疫印跡實驗
        2.2.9 染色質免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)
        2.2.10 數(shù)據分析
    2.3 實驗結果
        2.3.1 候選宿主蛋白與trVLPs-GP相互作用
        2.3.2 候選宿主蛋白與trVLPs-VP40相互作用
        2.3.3 候選宿主蛋白與trVLPs核酸相互作用
    2.4 討論
    2.5 參考文獻
第三部分 抗埃博拉病毒GP和VP40單克隆抗體的抗病毒效應研究
    3.1 背景
    3.2 材料和方法
        3.2.1 主要實驗試劑和耗材
        3.2.2 抗EBOV-GP和VP40單克隆抗體
        3.2.3 細胞和質粒
        3.2.4 trVLPs包裝、檢測
        3.2.5 RT-PCR驗證GP及VP40-mAbs體外抗trVLPs效應
        3.2.6 蛋白免疫印跡驗證GP及VP40-mAbs體外抗trVLPs效應
        3.2.7 細胞原位免疫熒光分析GP及VP40-mAbs抗trVLPs效應
        3.2.8 抗體可變域測序
        3.2.9 數(shù)據分析
    3.3 實驗結果
        3.3.1 抗GP和抗VP40抗體具備抗trVLPs效應
        3.3.2 抗GP和抗VP40抗體、抗VP40抗體之間的聯(lián)合(抗體的雞尾酒療法)具有協(xié)同抗病毒效應
        3.3.3 抗體測序
    3.4 討論
    3.5 參考文獻
綜述
    參考文獻
附錄
個人簡歷及攻讀博士學位期間所取得的科研成果



本文編號：3861485