發(fā)布時間：2023-10-06 14:03

　　目的:通過克隆表達細粒棘球蚴微管蛋白,并進行藥物相關作用研究,尋找在細粒棘球蚴的生命過程起重要作用、并可作為藥物靶點的微管蛋白同型。方法:采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)對細粒棘球蚴微管蛋白同型的表達水平進行分析;采用原核表達系統(tǒng)及鎳柱親和層析法表達、純化細粒棘球蚴微管蛋白 Tubulin-β4(EgTUB4)和 Tubulin-α9(EgTUA9)兩個同型,并利用 SDS-PAGE進行鑒定;用濁度法檢測微管蛋白溶液吸光值的變化以分析重組微管蛋白rEgTUB4和rEgTUA9的聚合效果并用透射電鏡觀察聚合產物的超微結構;將苯并咪唑類藥物同重組微管蛋白共孵育,觀察其對微管蛋白聚合反應的影響,同時用RT-PCR和Western blot法評價上述藥物對細粒棘球蚴微管蛋白同型基因轉錄和蛋白表達的影響。結果:細粒棘球蚴的多種微管蛋白同型的表達水平各不相同,其中Tubulin-α5、Tubulin-α9、Tubulin-β2(EgTUB2)、Tubulin-β4(EgTUB4)和 Tubulin-β6(EgTUB6)等5個同型在原頭節(jié)和囊壁組織中的表達水平均較高。原核表達得到rEgTUB4...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
常用縮寫詞中英文對照表
前言
    1 棘球蚴病的流行現(xiàn)狀
        1.1 細粒棘球蚴病
        1.2 多房棘球蚴病
        1.3 其他棘球蚴病
    2 棘球蚴病的治療措施
    3 棘球蚴病治療藥物的研究手段概述
    4 微管和微管蛋白
        4.1 微管的結構特點
        4.2 微管的動力學特征及生物學功能
        4.3 寄生蟲微管的研究現(xiàn)狀
        4.4 微管蛋白體外聚合反應的研究現(xiàn)狀
        4.5 微管蛋白抑制劑
    5 苯并咪唑類藥物的抗寄生蟲作用
    6 研究目的和意義
    7 研究目標與內容
        7.1 研究目標
        7.2 研究內容
第一部分 細粒棘球蚴微管蛋白的表達水平分析
    引言
    1 材料與試劑
        1.1 細粒棘球蚴原頭節(jié)和囊壁組織
        1.2 主要儀器與設備
        1.3 主要試劑與試劑盒
    2 方法與步驟
        2.1 基因組的搜索與引物設計
        2.2 總RNA的提取
        2.3 cDNA的合成
        2.4 細粒棘球蚴Tubulin-α和Tubulin-β同型基因的表達分析
    3 結果與分析
        3.1 總RNA的質量鑒定
        3.2 細粒棘球蚴Tubulin-α和Tubulin-β基因mRNA的表達量
            3.2.1 細粒棘球蚴Tubulin-α和Tubulin-β的擴增曲線及熔解曲線
            3.2.2 細粒棘球蚴各同型微管蛋白的相對表達量
    4 討論
第二部分 細粒棘球蚴微管蛋白的原核表達及純化
    引言
    1 材料與試劑
        1.1 原頭節(jié)cDNA
        1.2 主要儀器與設備
        1.3 主要試劑與試劑盒
    2 方法與步驟
        2.1 引物設計與合成
        2.2 原核表達載體的構建
            2.2.1 目標基因的擴增
            2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳及切膠
            2.2.3 目標片段的膠回收
            2.2.4 TA-克隆
            2.2.5 感受態(tài)細胞的轉化
            2.2.6 質粒抽提
            2.2.7 酶切及酶連
        2.3 重組蛋白的誘導表達及可溶性分析
        2.4 重組蛋白表達條件的優(yōu)化
        2.5 重組蛋白的大量表達及可溶性蛋白的純化
        2.6 重組蛋白的Western Blot驗證
    3 結果與分析
        3.1 目標基因的擴增
        3.2 菌落PCR驗證
        3.3 雙酶切鑒定
        3.4 重組蛋白的誘導表達及可溶性分析
        3.5 重組蛋白表達條件的優(yōu)化
        3.6 重組蛋白的純化
        3.7 重組蛋白的特異性鑒定
    4 討論
第三部分 細粒棘球蚴重組微管蛋白的體外聚合及苯并咪唑類藥物的影響
    引言
    1 材料與試劑
        1.1 原頭節(jié)
        1.2 主要儀器與設備
        1.3 主要試劑與試劑盒
    2 方法與步驟
        2.1 重組微管蛋白的體外聚合
            2.1.1 聚合產物的激光共聚焦觀察
            2.1.2 聚合產物的透射電鏡觀察
        2.2 苯并咪唑類藥物對重組微管蛋白體外聚合的影響
        2.3 苯并咪唑類藥物對豬腦微管蛋白體外聚合的影響
        2.4 苯并咪唑類藥物對原頭節(jié)基因轉錄及蛋白表達的影響
    3 結果與分析
        3.1 重組微管蛋白體外聚合濃度的優(yōu)化
            3.1.1 聚合產物的激光共聚焦觀察
            3.1.2 聚合產物的透射電鏡觀察
        3.2 苯并咪唑類藥物對重組微管蛋白體外聚合的影響
        3.3 苯并咪唑類藥物對豬腦微管蛋白體外聚合的影響
        3.4 苯并咪唑類藥物對原頭節(jié)微管蛋白基因mRNA表達量的影響
        3.5 苯并咪唑類藥物對原頭節(jié)微管蛋白基因蛋白表達的影響
    4 討論
結論和展望
參考文獻
綜述
    參考文獻
論著
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致謝



本文編號：3851842