目的探究野生型p53誘導(dǎo)磷酸酶1(Wip1)基因調(diào)控小鼠骨實質(zhì)來源間充質(zhì)干細胞(MSC)成脂肪細胞分化的作用與調(diào)控機制。方法分離培養(yǎng)Wip1基因敲除小鼠的MSC,觀察細胞形態(tài),流式細胞術(shù)檢測細胞表型和體外誘導(dǎo)分化鑒定MSC。利用油紅O染色和實時熒光定量PCR(RT-PCR)比較野生型MSC(WT-MSC)和Wip1敲除MSC(Wip1^-/-MSC)成脂分化后的脂滴數(shù)和成脂關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達。Western印跡(WB)檢測脂肪細胞分化關(guān)鍵蛋白蛋白質(zhì)磷酸酶2A(PP2A)的表達。分別收集MSC成脂誘導(dǎo)分化后第0、2、4和5天樣本,RT-PCR檢測成脂關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)與PP2A的表達相關(guān)性。構(gòu)建EGFP-Wip1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞,WB檢測過表達Wip1后細胞表達PP2A的差異。采用si RNA-PP2A瞬時轉(zhuǎn)染MSC,檢測PP2A敲低后PPARγ在MSC中的表達。結(jié)果分離培養(yǎng)的細胞形態(tài)呈成纖維樣,細胞表型為Sca-1⁺CD90⁺CD105⁺CD29⁺

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【文章目錄】：
1 材料和方法
     1.1 材料
         1.1.1 實驗動物
         1.1.2 細胞
         1.1.3 藥物與試劑
     1.2 方法
         1.2.1 小鼠骨實質(zhì)來源MSC的分離培養(yǎng)
         1.2.2 MSC成脂肪誘導(dǎo)及油紅O染料染色
         1.2.3 RNA提取與RT-PCR檢測
         1.2.4 流式細胞術(shù)檢測MSC細胞表型
         1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染
         1.2.6 Western印跡檢測
     1.3 統(tǒng)計學(xué)分析
2結(jié)果
    2.1 WT-MSC和Wip1-/-MSC分離培養(yǎng)與鑒定
    2.2 Wip1-/-MSC向脂肪細胞分化能力降低
    2.3 Wip1參與調(diào)控脂肪細胞分化關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PP2A的表達
    2.4 PP2A與PPARγ在MSC成脂分化過程中的相關(guān)性檢測
    2.5 Wip1通過PP2A影響PPARγ的表達
3討論



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