本文關(guān)鍵詞：IRAK2-Smurf1信號軸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)的修飾、加工、合成以及肽鏈的折疊和組裝運輸?shù)闹饕獔鏊?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過對蛋白質(zhì)的加工和修飾積極的參與到諸如細胞凋亡、調(diào)節(jié)血糖的濃度、鈣離子平衡的調(diào)節(jié)、合成膜脂以及合成激素等多種生理活動當(dāng)中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成的蛋白質(zhì)得不到及時的轉(zhuǎn)運、非折疊或錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量的積聚,又或者受到饑餓、缺氧、藥物影響、鈣離子平衡被打破等各種因素導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能受損。目前已經(jīng)證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與阿爾茨海默病、糖尿病、腎小管損傷、帕金森氏病、肝臟病毒性損傷和酒精性損傷等眾多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進細胞凋亡的機制主要包括未折疊蛋白反應(yīng)和鈣離子信號等幾大類。當(dāng)細胞內(nèi)鈣離子平衡被嚴重破壞時,細胞質(zhì)中依賴鈣離子的鈣蛋白酶(calpain)被激活并尋找到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Procaspasel2,將其剪切并活化,隨后通過一系列信號傳導(dǎo)最終導(dǎo)致細胞凋亡程序啟動：當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的合成、折疊、修飾蛋白質(zhì)功能受損而引起大量非折疊和錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會啟動一系列補救措施試圖糾正這些錯誤蛋白質(zhì),最終會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成功能下降、降解能力增強、發(fā)生細胞凋亡等一系列后續(xù)反應(yīng),這些由于積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未經(jīng)修飾的蛋白和錯誤折疊的蛋白多引發(fā)的反應(yīng)就是未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。而當(dāng)發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可以通過激活I(lǐng)RE1、ATF6和PERK三條信號傳導(dǎo)通路,此時的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會自我保護性的減少新蛋白的翻譯及生成、加強對錯誤折疊蛋白的降解來使自己重新恢復(fù)生理平衡,但過度的激活這三條通路都會不可避免的導(dǎo)致細胞啟動凋亡程序泛素化是指在酶促級聯(lián)反應(yīng)的作用下,泛素分子標(biāo)記在底物蛋白的過程。泛素化參與了細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)、炎癥免疫等諸多生命活動。泛素一蛋白酶體途徑是泛素發(fā)揮上述蛋白質(zhì)降解功能的主要途徑,主要由泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2以及泛素蛋白連接酶E3、去泛素化酶、26S蛋白酶體構(gòu)成。機體內(nèi)的E3主要分為兩大類：RING類E3以及HECT類E3,而目前對HECT類E3研究較多的是Nedd4家族。Nedd4家族在TNF-α、TGF-β以及BMP等多條信號傳導(dǎo)通路中起著不可或缺的調(diào)控功能。Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smurf1)是Nedd4家族中的一員,深入研究Smurf1后發(fā)現(xiàn)其不光在微觀層面對細胞生長和形態(tài)學(xué)改變、細胞遷移、細胞極性以及細胞的自我吞噬功能中起著重要的作用并且在骨形成、胚胎發(fā)育以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等宏觀生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的生理學(xué)功能。2005年時,一篇發(fā)表在Science雜志上的研究中,作者根據(jù)從大規(guī)模篩選結(jié)果,發(fā)現(xiàn)野生型和酶活突變型Smurf1與IRAK2相互作用預(yù)測分值很高,提示我們IRAK2可能和Smurf1以及TGF-B通路存在著交互作用,但究竟其具有何種生理影響等科學(xué)問題均未給與解答。白細胞介素1受體相關(guān)激酶(IRAKs)是Toll樣受體信號途徑中的關(guān)鍵調(diào)控分子。IRAK家族包括4個成員：IRAK1、IRAK2、IRAK3 (IRAK-M) 以及 IRAK4。家族成員都含有一個死亡結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)與、域可以與MyD88死亡結(jié)構(gòu)域相互作用的。IRAK2廣泛存在于各種人體組織中。在Toll樣受體信號通路中,發(fā)揮著承上啟下調(diào)控信號傳遞的作用,是固有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)免疫應(yīng)答不可缺少的關(guān)鍵激酶。我們對IRAK2和Smurf1之間的相互作用、作用方式和意義進行了深入細致的研究。首先我們構(gòu)建了人源Smurf1和IRAK2的真核表達載體,并且進行了免疫共沉淀相互作用實驗。發(fā)現(xiàn)Smurf1確實可以和IRAK2進行相互作用；隨后通過不同種屬來源的Smurf1和IRAK2的內(nèi)源抗體檢測,發(fā)現(xiàn)smurf1和IRAK2在內(nèi)源條件下也是存在相互作用的；并通過共定位和構(gòu)建Smurf1截短體證實了在細胞中IRAK2與Smurf1是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)這一結(jié)構(gòu)上發(fā)生相互作用的；隨后通過相互作用區(qū)域?qū)嶒炞C實Smurf1與IRAK2的相互作用主要是通過HECT結(jié)構(gòu)域來完成的。之后我們通過過量表達實驗卻發(fā)現(xiàn)雖然IRAK2對Smurf1的蛋白水平負調(diào)依賴于蛋白酶體途徑,但Smurf1并不是IRAK2的泛素連接酶E3,我們通過用慢病毒載體包裝病毒后構(gòu)建穩(wěn)定株也顯示敲低IRAK2后Smurf1蛋白水平上調(diào),說明IRAK2對Smurf1的蛋白水平具有負調(diào)節(jié)效應(yīng),于是我們構(gòu)建了IRAK2缺失酶活催化結(jié)構(gòu)域的截短體,并進行了磷酸化水平檢測。發(fā)現(xiàn)IRAK2可以明顯的促進smurf1蘇氨酸的磷酸化,并且的確磷酸化發(fā)生在HECT結(jié)構(gòu)域中的Thr114, Thr128, Thr437三個位點的蘇氨酸。結(jié)合共定位實驗的結(jié)果,我們設(shè)想IRAK2對Smurf1的負調(diào)控功能可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相關(guān)功能有聯(lián)系。于是檢測了毒胡蘿卜素(Thapsigargin)刺激情況下的IRAK2介導(dǎo)的ER stress通路和smurf1介導(dǎo)的ER stress通路的響應(yīng)情況,發(fā)現(xiàn)確實IRAK2和Smurf1呈現(xiàn)負相關(guān)：隨后我們再次檢測了敲低IRAK2細胞株中Smurf1介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號通路動態(tài)變化,結(jié)果顯示敲低IRAK2的細胞株,Smurf1下游的WFS1以及ATF6的蛋白含量變化,證明IRAK2確實通過Smurf1調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)應(yīng)激信號通路。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 磷酸化 IRAK2 Smurf1
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 中英文縮略語對照表12-13
• 第一章 前言13-17
• 第一節(jié) 泛素—蛋白酶體途徑13-15
• 第二節(jié) HECT類泛素連接酶及其成員Smurf1的結(jié)構(gòu)15-17
• 第二章 IRAK-2與泛素連接酶Smurf 1之間的相互作用17-27
• 第一節(jié) 背景資料17-21
• 第二節(jié) 材料與方法21-22
• 第三節(jié) 結(jié)果與討論22-27
• 第三章 IRAK-2對泛素連接酶Smurf 1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的調(diào)控27-36
• 第一節(jié) 背景資料27-31
• 第二節(jié) 材料與方法31
• 第三節(jié) 結(jié)果與討論31-36
• 第四章 討論36-39
• 參考文獻39-45
• 附錄45-56
• 附錄1 實驗常用方法詳細流程步驟45-50
• 附錄2 引物的設(shè)計與酶切位點設(shè)計50-51
• 附錄3 實驗主要使用材料來源、試劑配制及常用儀器設(shè)備51-56
• 文獻綜述56-70
• 參考文獻66-70
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況70-71
• 致謝71-72

【相似文獻】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉兢文;IRAK2-Smurf1信號軸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的功能研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

  本文關(guān)鍵詞：IRAK2-Smurf1信號軸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：374185