目的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的定向分化成平衡關(guān)系,一旦平衡被打破會(huì)導(dǎo)致骨代謝相關(guān)疾病的發(fā)生。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化具有很復(fù)雜的分子機(jī)制,涉及到多個(gè)相關(guān)基因和信號(hào)通路的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控也參與到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化調(diào)控中并發(fā)揮了重要的作用,但具體機(jī)制尚未研究清楚。本研究選取組蛋白去甲基化酶KDM4A（lysine-specific demethylase4A）作為研究對(duì)象,分別從功能、機(jī)制和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入探討其對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化的調(diào)控作用及相關(guān)分子機(jī)制。方法1、實(shí)時(shí)熒光PCR（q RT-PCR）檢測(cè)小鼠各個(gè)組織中Kdm4a的m RNA表達(dá)水平;分離并培養(yǎng)小鼠原代骨髓基質(zhì)中的干細(xì)胞,進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化,檢測(cè)Kdm4a在成脂和成骨分化過程的表達(dá)差異。在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系ST2和原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中升高或降低Kdm4a的表達(dá)水平,利用q RT-PCR、Western blotting檢測(cè)成骨和成脂相關(guān)基因在誘導(dǎo)后的表達(dá)變化,采用油紅O染色和堿性磷酸酶染色觀察KDM4A對(duì)細(xì)胞分化狀態(tài)的影響。構(gòu)建Kdm4a酶活性突變質(zhì)粒觀察喪失酶活性后KDM4A對(duì)細(xì)胞分化調(diào)控的改變。篩選KD... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：136 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

plvx-shRNA2質(zhì)粒圖譜

大學(xué)博士學(xué)位論文 KDM4A 對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞定向分化的果dm4a 在小鼠不同組織中的相對(duì)表達(dá)取 6 周齡 C57BL/6J 小鼠各組織的 mRNA，采用 qRT-PCR 方法檢dm4a 的表達(dá)變化。結(jié)果如圖 1.2 所示，Kdm4a 在骨和骨骼肌中高、腎和腦中表達(dá)量適中，在肝、肺、脾、結(jié)腸、腹股溝脂肪、附肪和腎周脂肪中表達(dá)量較低。以 Kdm4a 表達(dá)量最低的小腸組織作骼肌的表達(dá)量是在小腸中表達(dá)量的 88.9、42.5 倍。

圖 1.3 Kdm4a 在小鼠原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成脂和成骨分化過程中的 mRNA 表達(dá)變化A 圖：Adipogenic 為成脂誘導(dǎo)，B 圖：Osteogenic 為成骨誘導(dǎo)* p<0.05 vs.誘導(dǎo) 0d。1.2.3 Kdm4a 過表達(dá)質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒對(duì) ST2 細(xì)胞成脂和成骨分化的影響1.2.3.1 Kdm4a 突變型質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù) NCBI 獲得 Kdm4a 的基因序列，找到酶活性位點(diǎn)，分別將肽鏈上第 133位，138 位，165 位和 170 位的 G 突變?yōu)?A，設(shè)計(jì)合成誘變引物。因?yàn)橥蛔兾稽c(diǎn)之間不連續(xù)，因此設(shè)計(jì)兩對(duì)突變引物（在每個(gè)待突變位點(diǎn)處設(shè)計(jì)部分反向互補(bǔ)的引物對(duì)，每對(duì)正反向引物 5’端包含 15-21bp 反向互補(bǔ)區(qū)域），以野生型 Kdm4a質(zhì)粒作為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。兩對(duì)突變引物分別擴(kuò)增出兩個(gè)片段，DpnI 酶消化PCR 產(chǎn)物后切膠回收。兩個(gè)片段通過同源重組連接，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒即為 Kdm4a突變型質(zhì)粒（命名為 Kdm4a-Mut 質(zhì)粒），經(jīng)生物公司鑒定正確，在菌液中加入凍

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Lysine-specific demethylase 1 inhibitor rescues the osteogenic ability of mesenchymal stem cells under osteoporotic conditions by modulating H3K4 methylation[J]. Longwei Lv,Wenshu Ge,Yunsong Liu,Guanyou Lai,Hao Liu,Wenyue Li,Yongsheng Zhou.  Bone Research. 2016(04)



本文編號(hào)：3558942