發(fā)布時(shí)間：2017-05-10 21:04

  本文關(guān)鍵詞：糖皮質(zhì)激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的調(diào)控機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid, GC)是由腎上腺皮質(zhì)合成和分泌的應(yīng)激激素,其濃度受下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis, HPA軸)軸的調(diào)控。正常生理狀態(tài)下,糖皮質(zhì)激素對(duì)維持機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)的正常生長(zhǎng)發(fā)育以及生理和應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定都極為重要。糖皮質(zhì)激素作為很強(qiáng)的免疫抑制劑參與體內(nèi)多種代謝過(guò)程,調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。研究證實(shí),應(yīng)激反應(yīng)時(shí)腎上腺糖皮質(zhì)激素過(guò)度分泌與生殖內(nèi)分泌疾病密切相關(guān),糖皮質(zhì)激素能在下丘腦水平擾亂GnRH神經(jīng)元的正常生理活動(dòng),從而抑制其生殖內(nèi)分泌功能。GC能夠通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor, GR)介導(dǎo)直接作用于促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)神經(jīng)元,從而影響GnRH神經(jīng)元的正常生理活動(dòng)。下丘腦GnRH神經(jīng)元上存在GR,同時(shí),應(yīng)激狀態(tài)下的糖皮質(zhì)激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定影響。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要組成部分,近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),星形膠質(zhì)細(xì)胞除了參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和神經(jīng)退行性疾病以及具有巨噬細(xì)胞的功能以外,在調(diào)控生殖方面也具有重要作用。研究表明,下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌前列腺素E2 (Prostaglandin E2, PGE2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor-alpha, TGFβ)等活性因子,與GnRH神經(jīng)元上相應(yīng)的受體結(jié)合,促進(jìn)GnRH的合成和分泌,控制生殖活動(dòng)。另外,下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞還能通過(guò)黏合分子和GnRH神經(jīng)元結(jié)合,完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),促使GnRH神經(jīng)元分泌GnRH,從而調(diào)控生殖活動(dòng)。但是星形膠質(zhì)細(xì)胞能否直接分泌GnRH來(lái)控制生殖活動(dòng),還未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的大鼠下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞,探究糖皮質(zhì)激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的調(diào)控機(jī)制。因此,需要獲得較純的下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)采用重慶市中藥研究所提供的1-3日齡的SD新生大鼠,經(jīng)過(guò)原代細(xì)胞的分離培養(yǎng),在經(jīng)過(guò)多次純化和傳代培養(yǎng)獲得純化率達(dá)99%以上的星形膠質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)過(guò)以上方法所得的星形膠質(zhì)細(xì)胞可為體外研究提供符合要求的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的符合要求的星形膠質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)免疫熒光,熒光定量PCR, GnRH ELISA試劑盒檢驗(yàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞是否分泌GnRH,結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌GnRH。為了檢驗(yàn)GC對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte, AST)表達(dá)GnRH的影響,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用10-6mol/L,10-7mol/L,10-8mol/L的GC刺激培養(yǎng)的AST,分別檢測(cè)10min、20min、30min、40min時(shí)AST GnRH水平,選出最佳時(shí)間和濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用10-8mol/L的GC刺激培養(yǎng)的AST,在30min時(shí)GnRH的表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高(P0.05),該實(shí)驗(yàn)濃度和時(shí)間為最佳實(shí)驗(yàn)濃度和時(shí)間。為了檢驗(yàn)GC對(duì)AST GR的影響,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用10-6mol/L,10-7mol/L, 10-8mol/L的GC刺激培養(yǎng)的AST,分別檢測(cè)10min、20min、30min、40min時(shí)AST糖皮質(zhì)激素受體(GR)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10"8mol/L的GC刺激培養(yǎng)的AST,在40min時(shí)AST GR表達(dá)量較其他實(shí)驗(yàn)組顯著升高(P0.05)。為了研究GC對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的調(diào)節(jié)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用10-8mol/L的牛血清白蛋白偶聯(lián)的糖皮質(zhì)激素(BSA-GC),10-6mol/L的糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486,10-8mol/L GC刺激AST,在30min時(shí)檢測(cè)GnRH的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RU486+GC組、GC組和GC+BSA-GC組AST GnRH較對(duì)照組顯著升高(P0.05),證明短時(shí)間內(nèi)GC刺激AST分泌GnRH是通過(guò)非基因組效應(yīng)作用。為了了解GC作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)的AST,分別加10μM p38抑制劑SB203580、10μERK-1/-2抑制劑U0126、10μM JNK抑制劑SP600125。GC組加OμM SB203580、U0126和SP600125,繼續(xù)培養(yǎng)30min后,分別加入10-8mol/L的GC,在10min、20min、30min、40min時(shí)測(cè)定AST GnRH水平。對(duì)照組加入等體積的無(wú)水乙醇,在10min、20min、30min、40min時(shí)測(cè)定AST GnRH水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SB203580+GC組和U0126+GC組AST GnRH表達(dá)水平較對(duì)照組顯著下降(P0.05),SP600125+GC組AST GnRH表達(dá)水平變化不明顯(P0.05)。證明GC可以通過(guò)p38MAPK、ERK-1/-2MAPK轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑促進(jìn)AST GnRH的表達(dá)。為了進(jìn)一步探索GC作用的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否是PKC-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)的AST,加入1μM pkc抑制物星形孢菌素,繼續(xù)培養(yǎng)30min后,分別加入10-8mol/L的GC,在10min、20min、30min、40min時(shí)p38、ERK-1/-2、的磷酸化情況；在10min、20min、30min、40min時(shí)測(cè)定AST GnRH水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入PKC抑制劑+GC組AST GnRH的分泌較對(duì)照組明顯降低(P0.05),證明GC作用的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上游信號(hào)途徑和PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。綜上所述,該實(shí)驗(yàn)可以得到以下結(jié)論：1、體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)糖皮質(zhì)激素受體,為研究糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能奠定了形態(tài)學(xué)依據(jù)。2、首次發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌GnRH,這為星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控生殖提供了重要的生理學(xué)依據(jù)。3、糖皮質(zhì)激素可通過(guò)PKC-MAPK(p38)調(diào)節(jié)GnRH mRNA表達(dá),通過(guò)PKC-MAPK ERK-1/-2)調(diào)節(jié)其分泌。這為糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)生殖的機(jī)制提供了新的理論支持,對(duì)理解星形膠質(zhì)細(xì)胞在下丘腦-垂體-卵巢軸中的作用具有重要的生理學(xué)意義。
【關(guān)鍵詞】：星形膠質(zhì)細(xì)胞 糖皮質(zhì)激素 促性腺激素釋放激素 非基因組效應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 英文縮略語(yǔ)說(shuō)明7-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-22
• 1.1 糖皮質(zhì)激素的功能簡(jiǎn)介14-16
• 1.1.1 糖皮質(zhì)激素受體14-15
• 1.1.2 糖皮質(zhì)激素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的作用15
• 1.1.3 糖皮質(zhì)激素與生殖調(diào)控的關(guān)系15-16
• 1.1.4 糖皮質(zhì)激素調(diào)控生殖的主要途徑16
• 1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用16-19
• 1.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞一般生物學(xué)特性17
• 1.2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞與生殖調(diào)控的關(guān)系17-19
• 1.3 糖皮質(zhì)激素和星形膠質(zhì)細(xì)胞19-22
• 第二章 引言22-24
• 第三章 實(shí)驗(yàn)材料和方法24-34
• 3.1 試驗(yàn)材料24-28
• 3.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物24
• 3.1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)儀器24-25
• 3.1.3 試劑配制25-28
• 3.2 試驗(yàn)方法28-34
• 3.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)28-29
• 3.2.2 AST的免疫熒光鑒定29
• 3.2.3 GR和GnRH在AST中的表達(dá)29-31
• 3.2.4 不同濃度和時(shí)間GC對(duì)培養(yǎng)的AST GnRH和GR表達(dá)的影響31-33
• 3.2.5 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑對(duì)GC刺激培養(yǎng)的AST GnRH的調(diào)節(jié)33
• 3.2.6 PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑對(duì)GC刺激培養(yǎng)的AST GnRH的調(diào)節(jié)33
• 3.2.7 統(tǒng)計(jì)分析33-34
• 第四章 結(jié)果與分析34-54
• 4.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)34-35
• 4.1.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)34-35
• 4.1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)結(jié)果35
• 4.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定35-36
• 4.3 GR在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)36
• 4.4 GnRH在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)36-39
• 4.4.1 免疫熒光鑒定GnRH在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)36-37
• 4.4.2 熒光定量PCR檢測(cè)GnRH mRNA在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)37-38
• 4.4.3 Elisa檢測(cè)GnRH在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)38-39
• 4.5 不同濃度GC在不同時(shí)間對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GnRH表達(dá)的影響39-41
• 4.5.1 用Elisa測(cè)定GnRH在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平39
• 4.5.2 用熒光定量PCR測(cè)定GnRH在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平39-41
• 4.6 不同濃度GC在不同時(shí)間對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GR表達(dá)的影響41-42
• 4.7 GC核受體對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GnRH表達(dá)的影響42-44
• 4.7.1 用Elisa測(cè)定GnRH在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平42-43
• 4.7.2 用熒光定量PCR測(cè)定GnRH在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平43-44
• 4.8 MAPK信號(hào)通路在GC調(diào)節(jié)AST分泌GnRH過(guò)程中的作用44-48
• 4.8.1 利用ELISA檢測(cè)加入JNK抑制劑、p38抑制劑、ERK-1/-2抑制劑后AST GnRH的表達(dá)變化44-45
• 4.8.2 利用Western Blote檢測(cè)加入p38抑制劑、ERK-1/-2抑制劑后p38、ERK-1/-2磷酸化的變化45-47
• 4.8.3 利用熒光定量PCR檢測(cè)加入JNK抑制劑、p38抑制劑、ERK-1/-2抑制劑后AST GnRH mRNA的表達(dá)變化47-48
• 4.9 PKC信號(hào)通路在GC調(diào)節(jié)AST分泌GnRH過(guò)程中的作用48-54
• 4.9.1 利用Elisa檢測(cè)加入PKC抑制劑后AST分泌GnRH的表達(dá)變化48-49
• 4.9.2 利用熒光定量PCR檢測(cè)加入PKC抑制劑后AST分泌GnRH的表達(dá)變化49-50
• 4.9.3 利用Western Blot檢測(cè),加入PKC抑制劑后p38、ERK-1/-2磷酸化的變化50-54
• 第五章 討論54-58
• 5.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)54
• 5.2 糖皮質(zhì)激素調(diào)控AST分泌GnRH的非基因組機(jī)制討論54-55
• 5.3 糖皮質(zhì)激素對(duì)AST分泌GnRH的調(diào)控機(jī)制討論55-58
• 第六章 結(jié)論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 致謝66-67
• 在讀期間發(fā)表的文章67

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 劉春麗,周文霞,張永祥;糖皮質(zhì)激素對(duì)下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸的影響[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2004年01期

2 周欣;明曉云;康頌建;白波;段耀奎;;差速貼壁技術(shù)對(duì)大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞純化率的影響[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2007年15期

  本文關(guān)鍵詞：糖皮質(zhì)激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的調(diào)控機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：355445