人巨細(xì)胞病毒（HCMV）是全球范圍內(nèi)普遍感染的一種皰疹病毒,也是引起胎兒先天性畸形和器官移植受者死亡最常見的病原體。有研究表明,gH蛋白是HCMV主要的中和性抗原,特異性抗gH抗體具有中和HCMV及阻斷病毒在細(xì)胞間傳播的潛力。本研究以含人巨細(xì)胞病毒臨床株Toledo全基因組的細(xì)菌人工染色體（BAC）為模板,擴(kuò)增去除信號肽和跨膜區(qū)的gH基因片段,并將其插入表達(dá)載體構(gòu)建pET32a’-gH重組表達(dá)質(zhì)粒,將序列鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌株TransB,誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。用純化的重組gH蛋白免疫8周齡BALB/c雄鼠,經(jīng)雜交瘤技術(shù)獲得5株穩(wěn)定分泌抗gH單克隆抗體的細(xì)胞株,分別命名為8A9、8B4、8C4、8D9、8D12。所獲5株單克隆抗體對gH蛋白均具有良好的反應(yīng)性,其中8A9、8B4、8D9和8D12具有一定的病毒捕獲能力,且8D9和8D12的捕獲能力較強(qiáng)。本研究獲得了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗gH單克隆抗體,抗體具有良好的病毒捕獲能力。在此基礎(chǔ)上,我們將進(jìn)一步鑒定其是否為中和抗體,為今后開發(fā)治療HCMV感染的中和抗體奠定基礎(chǔ)。 

【文章來源】：激光生物學(xué)報. 2020,29(03)

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a"-gH的構(gòu)建

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TransB菌株，并用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。分別留取IPTG誘導(dǎo)前后的蛋白樣，并通過SDS-PAGE、WB鑒定蛋白表達(dá)情況。SDS-PAGE結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的重組菌株表達(dá)了一個約70 kD的蛋白(圖2a)。為驗證誘導(dǎo)表達(dá)蛋白是否為gH蛋白，我們以抗6×His-tag抗體作為一抗，使用WB對重組蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)菌株在70 kD處出現(xiàn)了特異性條帶，而對照菌株中沒有出現(xiàn)(圖2b)，提示菌株所表達(dá)的70 kD蛋白處為含有6×Histag的重組蛋白。超聲波破碎后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組表達(dá)菌株，SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組蛋白主要存在于沉淀中，說明該蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)(圖2a)。使用WB對重組蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定，與SDS-PAGE結(jié)果一致(圖2b)。大量表達(dá)gH，收集沉淀，后者經(jīng)洗滌、尿素變性后，用電洗脫方法進(jìn)行純化，收集純化前后的蛋白樣，并通過SDS-PAGE和WB鑒定gH純化情況(圖3)。結(jié)果顯示:與純化前相比，純化后gH僅有1條較亮的條帶，gH重組蛋白純化率達(dá)90%以上，達(dá)到免疫小鼠制備單克隆抗體的要求。圖3 重組gH蛋白的純化鑒定

重組gH蛋白的純化鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3475964