本文關鍵詞：超高壓脅迫改變副溶血性弧菌毒力的機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本文對從胃腸道患者糞便中分離得到的副溶血性弧菌C4株進行鑒定,并進行多輪的超高壓處理獲得具有耐壓遺傳特性的耐壓株N11。通過溶血實驗、生物被膜形成能力和小鼠急性毒性實驗、小鼠臟器損傷程度,來比較原始株C4和耐壓株N11的體內(nèi)毒力和體外毒力。以原始株C4和耐壓株N11的全基因組DNA為模板,構建C4株的Paired-end library、Mate-pair library文庫和N11株的Paired-end library文庫,進而采用Illumina高通量測序技術進行測序。對C4株的全基因組序列進行拼接、注釋、預測和COG分類,結合N11株的全基因組測序結果進行兩者間的比較基因組分析,以篩選N11株內(nèi)發(fā)生的突變堿基。最后,利用實時熒光定量PCR技術考察受突變位點調(diào)控的基因和毒力相關基因在C4和N11這兩株菌之間的差異表達,以分析超高壓脅迫改變副溶血性弧菌毒力的機理,為食品安全以及細菌毒性變化提供生物學依據(jù)。具體結論如下：對從胃腸道患者糞便中分離得到的菌株進行生化和基因型的鑒定,確定該菌株為副溶血性弧菌,并命名為C4株。以C4株為研究對象,經(jīng)過多輪超高壓馴化,得到耐壓株N11。溶血實驗表明C4和N11這兩株菌均有微弱的溶血現(xiàn)象,但是無法比較它們的毒力大小。生物被膜形成能力結果顯示,C4株的形成能力顯著高于N11株。小鼠急性毒性實驗表明,N11株的半數(shù)致死劑量(LDso)高于C4株；而進一步的小鼠臟器病理學分析結果亦顯示N11株對小鼠臟器的損傷程度較低,即超高壓處理減弱了副溶血性弧菌的毒力。對高通量測序得到的C4株reads進行組裝和拼接,最終得到含有12個scaffolds的全基因組序列,其中CDS、tRNA、rRNA的數(shù)量分別為4850、110、11個�；谌蚪M蛋白質(zhì)序列所構建的進化樹表明,C4株與副溶血性弧菌的親緣關系最近,這進一步證實C4株為副溶血性弧菌,以及基因預測的結果也較為理想。COG分類發(fā)現(xiàn)C4株內(nèi)有38%的基因參與了細菌的代謝過程；差異位點分析表明,N11株相對于C4株有4個區(qū)域共21個核苷酸發(fā)生了突變。對C4株全基因組序列上的毒力相關基因進行鑒定,發(fā)現(xiàn)C4株中存在編碼TDH-S、TDH-A、TLH的基因,但未發(fā)現(xiàn)編碼TRH的基因；存在兩組編碼Ⅳ型菌毛(Type Ⅳ pili,TFP)的基因,分別為角質(zhì)菌毛(Chitin-regulated pilus,ChiRP)以及甘露醇敏感凝血素IV型菌毛(mannose-sensitive hemagglutinin,MSHA);存在兩個ⅢI型分泌系統(tǒng),分別為TTSS1和TTSS2;未發(fā)現(xiàn)編碼尿素酶的基因。以培養(yǎng)中的C4和N11株的mRNA為模板,采用實時熒光定量PCR分析毒力基因的相對表達水平,發(fā)現(xiàn)編碼主要溶血毒素和MSHA的基因在N11株中的表達量顯著低于C4株,溶血毒素是副溶血性弧菌中的主要毒力因子,N11株表達量的減少可能是其毒力降低的主要原因。此外,通過實時熒光定量PCR分析了受突變位點調(diào)控的上下游基因：C4_4795基因編碼生成RNA結合蛋白,發(fā)現(xiàn)該基因的mRNA表達水平發(fā)生下調(diào),推測這可能會導致N11株毒力的降低；C4 4609基因可翻譯成HD-GYP結構域,在N11株中該基因的mRNA表達水平下調(diào),有可能削弱對環(huán)鳥苷二磷酸(c-di-GMP)的降解作用,進而減弱了N11株的運動性和毒力因子的產(chǎn)生,從而降低了耐壓株N11的毒力。
【關鍵詞】：副溶血性弧菌 超高壓處理 耐壓 毒力變化
【學位授予單位】：浙江工商大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-13
• 第1章 前言13-23
• 1.1 細菌的致病性及其影響因素13-15
• 1.1.1 細菌的致病性13
• 1.1.2 細菌致病性的影響因素13-15
• 1.1.2.1 侵襲力13-14
• 1.1.2.2 細菌毒素14
• 1.1.2.3 細菌侵入的數(shù)量14
• 1.1.2.4 細菌侵入機體的途徑14-15
• 1.2 副溶血性弧菌的生物學特性及其主要毒力因子15-19
• 1.2.1 生物學特性15-16
• 1.2.2 副溶血弧菌的主要毒力因子16-19
• 1.2.2.1 溶血毒素16-17
• 1.2.2.2 粘附因子17-18
• 1.2.2.3 胞外蛋白酶18
• 1.2.2.4 尿素酶(Ure)18
• 1.2.2.5 Ⅲ型分泌系統(tǒng)18-19
• 1.2.2.6 其他毒力因子19
• 1.3 堿基突變對生物性狀的影響19-21
• 1.3.1 堿基突變的誘因19-20
• 1.3.2 堿基突變對生物個體的影響20-21
• 1.4 技術路線、研究內(nèi)容及意義21-23
• 1.4.1 技術路線21
• 1.4.2 研究內(nèi)容21-22
• 1.4.2.1 菌株鑒定、篩選及毒力評價21
• 1.4.2.2 基因組測序、分析及差異位點分析21-22
• 1.4.2.3 全基因組中毒力基因分析及其與突變位點相關基因的差異表達分析22
• 1.4.3 研究意義22-23
• 第2章 菌株鑒定、篩選及毒力評價23-41
• 2.1 引言23
• 2.2 材料與儀器23-24
• 2.2.1 菌種與材料23-24
• 2.2.2 儀器與設備24
• 2.3 實驗方法24-30
• 2.3.1 菌株的分離與培養(yǎng)24-25
• 2.3.2 生化鑒定25
• 2.3.3 細菌總DNA的提取及PCR驗證25-26
• 2.3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建及在線比對26
• 2.3.5 生長曲線的繪制26-27
• 2.3.6 耐壓菌株的篩選27
• 2.3.7 菌株體外毒力測定27-28
• 2.3.7.1 溶血性測定27
• 2.3.7.2 生物被膜形成能力測定27-28
• 2.3.8 菌株體內(nèi)毒力測定28-30
• 2.3.8.1 小鼠急性毒性實驗28-29
• 2.3.8.2 小鼠肝臟與脾臟組織切片和HE染色29-30
• 2.4 結果與討論30-39
• 2.4.1 生化鑒定結果30-31
• 2.4.2 基因型鑒定結果31-34
• 2.4.3 耐壓菌株的篩選結果及菌株的生長曲線34-35
• 2.4.4 菌株體外毒力測定結果35-36
• 2.4.4.1 溶血性測定結果35-36
• 2.4.4.2 生物被膜形成能力的比較36
• 2.4.5 菌株體內(nèi)毒力測定結果36-39
• 2.4.5.1 小鼠急性毒性實驗36-37
• 2.4.5.2 病理組織學變化37-39
• 2.5 本章小結39-41
• 第3章 基因組測序及分析41-56
• 3.1 引言41
• 3.2 材料與儀器41-42
• 3.2.1 菌株與材料41
• 3.2.2 儀器與設備41-42
• 3.3 實驗方法42-45
• 3.3.1 基因組DNA的提取及檢測42
• 3.3.2 基因組測序和預處理42
• 3.3.3 基因組拼接、預測和注釋42-43
• 3.3.4 構建全基因組的系統(tǒng)發(fā)育樹43-44
• 3.3.5 COG分類44
• 3.3.6 兩株菌全基因組差異位點分析44-45
• 3.4 結果與討論45-55
• 3.4.1 DNA樣品質(zhì)量檢測結果45-46
• 3.4.2 reads質(zhì)量滿足基因組分析46-48
• 3.4.3 基因組拼接結果和預測48-50
• 3.4.4 C4菌株的進化分析50-51
• 3.4.5 基因的COG分類51-53
• 3.4.6 非編碼區(qū)基因位點發(fā)生突變53-55
• 3.5 本章總結55-56
• 第4章 毒力基因及突變位點相關基因的差異表達分析56-68
• 4.1 引言56
• 4.2 材料與儀器56-57
• 4.2.1 實驗材料56-57
• 4.2.2 儀器與設備57
• 4.3 實驗方法57-60
• 4.3.1 基因組中毒力相關基因分析57
• 4.3.2 全基因組RNA的提取57
• 4.3.3 RNA中基因組DNA的去除57-58
• 4.3.4 cDNA的合成58
• 4.3.5 實時熒光定量PCR58-60
• 4.4 結果與討論60-67
• 4.4.1 菌株中毒力相關基因的分布60-64
• 4.4.2 主要毒力因子的差異表達64-65
• 4.4.3 突變位點鄰近基因的差異表達65-67
• 4.5 本章總結67-68
• 第5章 結論、創(chuàng)新點與展望68-71
• 5.1 結論68-69
• 5.2 創(chuàng)新點69
• 5.3 展望69-71
• 參考文獻71-77
• 碩士期間發(fā)表的論文77-78
• 致謝78-79

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李志峰,戴迎春;副溶血弧菌的溶血毒素研究現(xiàn)況[J];解放軍預防醫(yī)學雜志;2003年01期

  本文關鍵詞：超高壓脅迫改變副溶血性弧菌毒力的機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：343673