目的:構(gòu)建PLIN1基因敲除載體,敲除3T3-L1前脂肪細胞中PLIN1基因,有效降低PLIN1蛋白的表達,研究脂肪細胞中PLIN1基因敲除對脂肪水解的影響,并探究其機制。方法:1.利用CRISPR/Cas9技術(shù),雙酶切法構(gòu)建PLIN1基因敲除載體,DNA測序技術(shù)鑒定載體;常規(guī)培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞,PCR擴增PLIN1基因目的片段;sgRNA體外轉(zhuǎn)錄,Cas9體外酶切,鑒定sgRNA活性。2.電穿孔轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細胞,嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染成功的細胞;優(yōu)化的“雞尾酒”法,誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細胞分化;Western blot檢測脂肪細胞中PLIN1蛋白的表達,RT-PCR檢測PLIN1 mRNA相對表達量,檢驗陽性載體的敲除作用。3.油紅O染色脂肪細胞中脂滴,測量脂滴大小、讀計脂滴數(shù)量;酶法測定脂肪細胞中甘油三酯和甘油含量,了解細胞脂解情況;Western blot法檢測細胞中脂解酶、Fsp27、PPARγ蛋白表達,RT-PCR檢測細胞中HSL、ATGL mRNA相對表達量。結(jié)果:1.3個sgRNA均可以識別PLIN1基因靶點,發(fā)揮作用,體外酶切活性檢測均有效;3個敲除載體的... 

【文章來源】：山西醫(yī)科大學(xué)山西省

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PX459質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

圖 1-2 PLIN1 敲除載體測序圖2.2 PLIN1 目的片段 PCR 擴增結(jié)果2.2.1 PLIN1 目的片段擴增引物根據(jù)引物設(shè)計原則以及CRISPR基因敲除原理，設(shè)計PLIN1基因PCR擴增引物，上下游引物為：PLIN1-F：5’- GCAGAGGTAGACAGCCCAAG -3’；PLIN1-R：5’-TCCTGCCACTGGTCCTACTC-3’。2.2.2 PLIN1 目的片段瓊脂糖凝膠結(jié)果如圖 1-3 所示瓊脂糖凝膠電泳后目的條帶約處于 800 bp 左右，與預(yù)期結(jié)果（781bp）相同。

圖 1-2 PLIN1 敲除載體測序圖片段 PCR 擴增結(jié)果片段擴增引物計原則以及CRISPR基因敲除原理，設(shè)計PLIN1基因PCPLIN1-F：5’- GCAGAGGTAGACAGCCCAAG -3’；GTCCTACTC-3’。片段瓊脂糖凝膠結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳后目的條帶約處于 800 bp 左右，與預(yù)

【參考文獻】：
期刊論文
[1]楊梅素聯(lián)合圍脂滴蛋白對脂肪細胞脂解的影響[J]. 張少華,王君實,董維鵬,燕炯.  中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志. 2018(33)
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[3]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)快速高效構(gòu)建血友病乙小鼠模型[J]. 汪啟翰,懷聰,孫瑞林,莊華,陳紅巖,費儉,盧大儒.  遺傳. 2015(11)
[4]小鼠3T3-L1前脂肪細胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化方法的建立[J]. 郭秀玲,徐民崗,張秀麗,師磊,陳顯久.  中國藥物與臨床. 2013(12)

博士論文
[1]利用CRISPR/Cas9進行基因編輯[D]. 沈彬.南京大學(xué) 2014



本文編號：3414450