谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的興奮性氨基酸遞質(zhì),因其不能在胞外代謝,胞外溶液中多余的谷氨酸只能依靠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,excitatory amino acid transporters,EAATs）進(jìn)行回收利用,否則突觸間隙內(nèi)過量的谷氨酸會造成神經(jīng)元的興奮性毒性損傷。因此,谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在預(yù)防神經(jīng)興奮性毒性方面極為重要。真核EAAT和原核谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體具有相似的蛋白結(jié)構(gòu),它們均由三個相同的楔形亞基聚合而成,但與原核相比,EAAT的4b-4c環(huán)多了 50多個氨基酸殘基,提示EAAT的4b-4c環(huán)可能具有不一樣的作用。雖然EAATlcryst的晶體結(jié)構(gòu)已破解,但其4b-4c環(huán)的原有殘基中,有26個被刪除了且有18個被突變了,因而無法反映4b-4c環(huán)天然的結(jié)構(gòu)信息。考慮到4b-4c環(huán)與EAATs的功能及亞細(xì)胞定位密切相關(guān),我們推測環(huán)上可能存在某些影響蛋白活性的關(guān)鍵氨基酸殘基;另外,由于4b-4c環(huán)在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中還支持螺旋發(fā)卡環(huán)（helical hairpin,HP）1、HP2及跨膜區(qū)段（transmembrane domain,TM）7參與局部變構(gòu),我們推測4b-4c環(huán)與TM8之間... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：123 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖２．?ＥＡＡＴｓ的轉(zhuǎn)運(yùn)模式

層膜內(nèi)底物結(jié)合位點(diǎn)的側(cè)面為蛋白的內(nèi)外閘門，而內(nèi)外閘門的運(yùn)動使底物得以??交替接近細(xì)胞內(nèi)外的溶液［４２］，從而表現(xiàn)為蛋白在向外開放時相、底物結(jié)合時相??以及向內(nèi)開放時相之間的循環(huán)變構(gòu)（圖３?）。在變構(gòu)過程中，外側(cè)閘門ＨＰ２首先??移向胞外并暴露底物的結(jié)合位點(diǎn)，然后在轉(zhuǎn)運(yùn)體與底物、離子結(jié)合后恢復(fù)閉合??態(tài)，接著，底物結(jié)合區(qū)（主要包括ＨＰ１、ＨＰ２、ＴＭ７及ＴＭ８的部分區(qū)段）向胞??漿側(cè)移動，轉(zhuǎn)運(yùn)體逐漸過渡到向內(nèi)開放構(gòu)象，直至內(nèi)側(cè)閘門ＨＰ１向內(nèi)開放并將??底物和離子釋放至胞內(nèi)１４２＿４４］，最后，Ｋ＋與向內(nèi)開放的轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合，進(jìn)而促使轉(zhuǎn)??運(yùn)體變構(gòu)為向外開放的初始態(tài)［４３］。由于最后一步是整個轉(zhuǎn)運(yùn)周期的限速步驟

Ａ２１２、Ａ２２０和Ａ２４３）被突變?yōu)槔i氨酸（因纈氨酸也是非極性氨基酸，且側(cè)鏈??比丙氨酸的側(cè)鏈稍大），這步突變的目的在于查看四個原有的丙氨酸殘基是否也??顯著影響ＥＡＡＴ１的正常功能。結(jié)果如圖１－１所示，與野生型ＥＡＡＴ１相比，超過??９０％的突變體對Ｄ－［３Ｈ］－Ａｓｐａｔａｔｅ仍保留了?６０％以上的攝取活性。而Ｔ１９２Ａ、??Ｙ１９４Ａ、Ｎ２４２Ａ及Ｇ２４５Ａ突變體的攝取活性顯著下降，它們對Ｄ－［３Ｈ］－Ａｓｐａｔａｔｅ??的攝取活性分別為（４．２５?±２．２５）?％、（１２．８２?±７．２１）?％、（９．０１?±２．５７）?％和（８．１０??±４．５９）?％?（ｎ?＝?３）。我們發(fā)現(xiàn)Ｔ１９２、Ｙ１９４、Ｎ２４２及Ｇ２４５四個氨基酸殘基恰巧??集中分布于４ｂ－４ｃ環(huán)兩端，而這兩端也是４ｂ－４ｃ環(huán)最接近轉(zhuǎn)運(yùn)體底物結(jié)合袋的部??位（圖１．１?Ｂ）。綜合以上結(jié)果分析，Ｔ１９２、Ｙ１９４、Ｎ２４２和Ｇ２４５很可能是ＥＡＡＴ１??完成底物轉(zhuǎn)運(yùn)所必需的關(guān)鍵氨基酸殘基，因此，本研宄選擇圍繞這四個位點(diǎn)的??氨基酸殘基做進(jìn)一步分析。??３７??


本文編號：3411508