為研發(fā)一種更安全、有效的結(jié)核病疫苗,用于預防并清除結(jié)核病,本試驗構(gòu)建4株分別表達Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因的重組卡介苗,參考pMV261載體序列和Tuberculist上登錄的H37Rv序列設(shè)計引物,通過PCR擴增和無縫克隆技術(shù)構(gòu)建含Ag85基因片段的重組pMV261質(zhì)粒。分別對重組質(zhì)粒進行PCR、雙酶切鑒定后,通過電擊轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染到卡介苗感受態(tài)細胞中,利用Kan耐藥基因篩選獲得重組卡介苗菌株。采用PCR及Western blotting鑒定Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因在卡介苗中的表達,再對構(gòu)建成功的重組卡介苗進行培養(yǎng),用于后續(xù)試驗。PCR擴增結(jié)果表明,構(gòu)建的重組卡介苗rBCG/Ag85A、rBCG/Ag85B、rBCG/Ag85C和rBCG/Ag85D目的基因片段大小分別為1 447、1 402、1 453和1 330 bp,與預期大小一致,表明目的基因已成功整合到卡介苗中;Western blotting結(jié)果表明,Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因均可在卡介苗細胞內(nèi)成功表達。本試驗利用基因工程技術(shù)成功獲得4株分別表達Ag85... 

【文章來源】：中國畜牧獸醫(yī). 2020,47(02)北大核心

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線性化載體及目的基因PCR擴增結(jié)果

分別以重組質(zhì)粒pMV261-Ag85A、pMV261-Ag85B、pMV261-Ag85C、pMV261-Ag85D為模板,利用引物對pMV261-1進行PCR鑒定,結(jié)果顯示,在1 400 bp左右均出現(xiàn)特異性條帶(圖2),與預期結(jié)果一致。分別使用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ對4個重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。質(zhì)粒pMV261-Ag85B、pMV261-Ag85C、pMV261-Ag85D酶切后得到兩條大小不同的片段,分別為載體片段4 334 bp和Ag85(B、C、D)片段大小1 002、1 053和930 bp,pMV261-Ag85A質(zhì)粒酶切后得到3條大小不同的片段,分別為4 334、682和365 bp(圖3),均與預期結(jié)果一致。將鑒定正確的重組載體進行序列測定,測序結(jié)果與Tuberculist中公布的Ag85A、Ag85B、Ag85C、Ag85D基因序列進行比對,核苷酸及氨基酸序列相似性均為99%。表明4個重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。圖3 重組質(zhì)粒BamH Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒BamH Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定結(jié)果

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3317944