目的構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)成熟miRNA-30a和miRNA-30e腺病毒表達(dá)載體。方法小鼠基因組中分別擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)的mmu-miR-30a、mmu-miR-30e目的基因,目的基因連接到穿梭質(zhì)粒pSES-HUS,帶有目的基因的穿梭質(zhì)粒重組到骨架質(zhì)粒AdEasy1上,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hek-293細(xì)胞中包裝成腺病毒載體,反復(fù)擴(kuò)增之后獲得高滴度的pAd-mmu-miR-30a、pAd-mmu-miR-30e腺病毒。用目的腺病毒分3組（RFP對(duì)照組,miR-30a組,miR-30e組）感染小鼠Mefs細(xì)胞,用熒光定量PCR方法檢測(cè)mmu-miR-30a、mmu-miR-30e表達(dá)情況。結(jié)果分別擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)的357 bp mmu-miR-30a,324 bp mmu-miR-30e,并成功連接到pSES-HUS上,進(jìn)一步與AdEasy1重組,包裝得到腺病毒表達(dá)載體,通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè),Mefs細(xì)胞中mmu-miR-30a升高26.46±7.46倍,mmu-miR-30e升高2.76±0.25倍。結(jié)論成功構(gòu)建了成熟miRNA的腺病毒表達(dá)載體。 

【文章來(lái)源】：南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2013,33(02)北大核心CSCD

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 實(shí)驗(yàn)材料
    1.2 實(shí)驗(yàn)方法
        1.2.1 小鼠基因組DNA的提取
        1.2.2 引物設(shè)計(jì)
        1.2.3 目的片段的獲得
        1.2.4 目的片段亞克隆到穿梭質(zhì)粒p SES-HUS
        1.2.5 亞克隆產(chǎn)物的擴(kuò)增、篩選及鑒定
        1.2.6 重組質(zhì)粒的獲得及Hek-293細(xì)胞內(nèi)包裝成腺病毒
        1.2.7 高滴度腺病毒表達(dá)載體的獲得
        1.2.8 熒光定量PCR鑒定mi RNA-30a和mi RNA-30e的表達(dá)情況
    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
    2.1 目的片段的分離擴(kuò)增
    2.2 克隆產(chǎn)物的獲得及篩選鑒定
    2.3 重組質(zhì)粒的鑒定
    2.4 Hek-293細(xì)胞中包裝腺病毒結(jié)果
    2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定p Ad-mi R-30a和p Ad-mi R-30e的表達(dá)情況
3 討論



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