本文關鍵詞：SIRT1的選擇性剪接在衰老過程中的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：衰老是生物體內發(fā)生的漸進性多器官、多層次、多方面的復雜變化過程,其后果是機體功能的衰退或失調。機體衰老的基礎是細胞的衰老,這一過程受遺傳和環(huán)境因素的共同調節(jié)。目前,雖然有多種學說從不同方面解釋衰老的發(fā)生,但其關鍵機制以及調控方式仍不明確。沉默信息調節(jié)因子2同源物1(Silent mating type information regulation2 homolog1,SIRT1)是一個NAD+依賴的組蛋白脫乙�；�,經(jīng)其去乙酰化作用影響P53,P16,FOXO,NF-κB,和PGC-1α等不同的下游分子,進而對細胞的衰老、程序性死亡、新陳代謝等不同過程進行調控。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在熱量限制(Caloric restriction,CR)引起的生命周期的延長中發(fā)揮了關鍵作用,從而引發(fā)了研究者的廣泛興趣。在體外,SIRT1能夠抑制氧化應激和高糖誘導的內皮細胞以及干細胞的衰老;在嚙齒類動物的相關研究也發(fā)現(xiàn),SIRT1在衰老過程以及年齡依賴的器官功能下降中發(fā)揮重要作用。然而SIRT1對部分下游分子,甚至生理或病理進程的作用研究常常存在相互矛盾的報道。這提示SIRT1的功能可能存在更加復雜的機制和調控因素。SIRT1的序列高度保守,且長期被認為不存在剪接變異體。但2010年Lynch等的研究顯示人類及小鼠的SIRT1 pre-m RNA存在選擇性剪接,即產(chǎn)生缺失第八外顯子的SIRT1(SIRT1-ΔExon8)和SIRT1全長(SIRT1-FL)兩種變異體。新近研究發(fā)現(xiàn),SIRT1-ΔExon8的生物學作用及調控機制與SIRT1-FL存在較大差異。在前期的實驗過程中,我們發(fā)現(xiàn)大鼠體內可能也存在SIRT1的選擇性剪接,由于大鼠與人和小鼠的SIRT1結構不同,后者具有9個外顯子,而大鼠具有8個外顯子,因此其產(chǎn)生的選擇性變異體也不同。實驗顯示,大鼠可能產(chǎn)生與小鼠或人SIRT1-ΔExon8的生物學作用與調控機制相似的缺失第七外顯子的SIRT1(SIRT1-ΔExon7)。已知SIRT1在衰老進程中發(fā)揮著重要作用,但其剪接變異體是否影響衰老進程目前尚無報道。本研究在前期實驗的基礎上,利用衰老的細胞模型和動物實驗證實大鼠的選擇性剪接,以及觀察大鼠SIRT1的選擇性剪接在衰老過程可能發(fā)揮的作用。第一部分SIRT1-ΔExon8在D-半乳糖誘導的293T細胞衰老模型中的作用觀察目的:通過觀察缺失第八外顯子的SIRT1選擇性剪接變異體(SIRT1-ΔExon8)在D-半乳糖(D-gal)誘導的293T細胞衰老模型中的表達變化,初步探討SIRT1-ΔExon8對細胞衰老進程的影響。方法:1.CCK8法測定不同濃度D-半乳糖(0,5,10,15,20 g/L)對293T細胞活力的影響。2.選取終濃度為10 g/L的D-半乳糖DMEM高糖培養(yǎng)基作用于第3代293T細胞,繼續(xù)培養(yǎng)至第6代,建立細胞衰老模型,應用衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色方法觀察衰老細胞的陽性率。3.RT-PCR檢測誘導組與對照組細胞中SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon8 m RNA的表達水平。結果:1.CCK-8結果顯示10 g/L的D-半乳糖培養(yǎng)基能誘導細胞衰老且不引起細胞過度損傷。2.誘導組衰老細胞陽性率74.25±3.62%高于對照組7.68±1.43%(P0.05)。3.RT-PCR結果顯示誘導組SIRT1-FL和SIRT1-ΔExon8 m RNA表達水平分別較對照組降低了78.26±5.16%和88.03±3.27%(P0.05)。小結:1.SA-β-gal染色結果提示D-半乳糖誘導的293T細胞衰老模型建立成功。2.衰老細胞組的SIRT1-FL以及SIRT1-ΔExon8 m RNA表達水平較對照組均顯著降低,提示SIRT1-FL和SIRT1-ΔExon8可能參與調控細胞衰老進程。第二部分SIRT1-ΔExon7在大鼠衰老過程中的表達改變及意義目的:證實大鼠海馬組織中存在SIRT1的選擇性剪接變異體;觀察SIRT1全長及缺失第七外顯子的SIRT1選擇性剪接變異體(SIRT1-ΔExon7)在不同年齡段大鼠海馬組織中表達變化,從而初步探討SIRT1全長及SIRT1-ΔExon7在衰老進程中的表達改變。方法:1.通過PCR產(chǎn)物的凝膠電泳及c DNA測序檢測擴增目的基因是否為SIRT1-ΔExon7。2.將不同日齡(P7,P90,P720)大鼠海馬組織進行冰凍切片,并應用SA-β-gal染色并觀察細胞衰老陽性率。3.RT-PCR測定不同年齡段大鼠海馬組織中SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon7 m RNA的表達水平。結果:1.瓊脂糖凝膠電泳及測序結果顯示,大鼠海馬組織存在SIRT1-ΔExon7的表達。2.SA-β-gal染色結果顯示新生鼠偶見SA-β-gal陽性衰老細胞,而老年大鼠可見大量胞漿呈淡藍色的SA-β-gal陽性衰老細胞,提示隨年齡增加大鼠腦內細胞的SA-β-gal活性逐漸增強,衰老細胞呈年齡依賴性遞增趨勢。3.RT-PCR結果顯示P90組及P720組SIRT1-FL m RNA表達水平與P7組相比均無明顯差異;而SIRT1-ΔExon7 m RNA表達水平分別升高了77.40±7.38%和89.28±9.23%(P0.05)。小結:1.大鼠體內存在缺失第7外顯子的SIRT1選擇性剪接變異體。2.SIRT1-ΔExon7在衰老海馬組織中呈現(xiàn)高表達。第三部分SIRT1-ΔExon7在誘導大鼠MSCs衰老細胞中的表達變化及意義目的:為了更進一步研究SIRT1以及SIRT-Δ7在衰老過程的作用,我們采用誘導大鼠骨髓間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)衰老細胞模型,觀察SIRT-Δ7在細胞衰老過程中的表達變化。方法:1.將MSCs細胞反復傳代至第18代,β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色觀察衰老細胞陽性率。2.RT-PCR檢測衰老組與對照組細胞中SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon7 m RNA的表達水平。結果:1.隨著細胞不斷傳代SA-β-gal陽性衰老細胞增加,衰老組細胞陽性率57.64%±7.39%明顯高于對照組16.35%±2.17%(P0.05)。2.RT-PCR結果顯示衰老組SIRT1-FL m RNA表達水平較對照組降低了20.09±2.74%(P0.05);和SIRT1-ΔExon7m RNA表達水平較對照組升高了132.85±11.07%(P0.05)。小結:衰老細胞中SIRT1-ΔExon7表達顯著升高,提示SIRT1-ΔExon7可能在衰老過程發(fā)揮作用。結論:1.首次證實大鼠存在SIRT1的選擇性剪接,形成選擇性變異體SIRT1-ΔExon7,而不是之前報道的SIRT1-ΔExon8。2.整體動物及離體實驗(兩種來源的細胞)均觀察到衰老過程中SIRT1-ΔExon7表達水平的改變,提示SIRT1的選擇性剪接可能在衰老進程發(fā)揮作用。
【關鍵詞】：衰老 SIRT1 選擇性剪接 SIRT1-ΔExon8 SIRT1-ΔExon7 大鼠
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R339.38
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 常用縮寫詞中英文對照表14-15
• 前言15-17
• 第一部分 SIRT1-ΔExon8在D-半乳糖誘導的293T細胞衰老模型中的作用觀察17-27
• 1 材料與方法17-23
• 1.1 材料和試劑17-19
• 1.2 實驗方法19-22
• 1.3 圖像分析和統(tǒng)計學處理22-23
• 2 結果23-25
• 2.1 CCK-8 法檢測細胞活力23
• 2.2 衰老相關的SA-β-gal染色23-24
• 2.3 RT-PCR檢測SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon8 的mRNA含量24-25
• 3 討論25-27
• 第二部分 SIRT1-ΔExon7 在大鼠衰老過程中的表達改變及意義27-35
• 1 材料與方法27-30
• 1.1 材料和試劑27-29
• 1.2 實驗方法29
• 1.3 圖像分析和統(tǒng)計學處理29-30
• 2 結果30-33
• 2.1 大鼠缺失第七外顯子SIRT1 mRNA的鑒定30-31
• 2.2 衰老相關SA-β-gal染色31
• 2.3 缺失第7外顯子的SIRT1 在衰老組的表達發(fā)生改變31-33
• 3 討論33-35
• 第三部分 SIRT1-ΔExon7 在誘導大鼠MSCs衰老細胞中的表達變化及意義35-43
• 1 材料與方法35-39
• 1.1 材料和試劑35-37
• 1.2.實驗方法37
• 1.3 圖像分析和統(tǒng)計學處理37-39
• 2 結果39-41
• 2.1 衰老相關SA-β-gal染色39
• 2.2 SYBR Green Real-time PCR39-41
• 3 討論41-43
• 結論43-44
• 參考文獻44-48
• 綜述48-53
• 參考文獻51-53
• 致謝53-54
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果54-55
• 個人簡歷55

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4 張平;衰老過程中線粒體的分子病理[J];中華病理學雜志;1998年01期

5 Walsh RA;楊品清;;衰老過程對心血管的影響[J];國外醫(yī)學(老年醫(yī)學分冊);1988年02期

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8 鄭集;;代謝在衰老過程中的改變[J];生命的化學(中國生物化學會通訊);1992年02期

9 曾秋蓮,徐杰,尹漢萍,董宇亮;花衰老過程中的生理生化變化及對花衰老的調節(jié)(綜述)[J];亞熱帶植物科學;2004年03期

10 馬彩云;;人體免疫功能在衰老過程中的改變[J];赤峰教育學院學報;2001年01期

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1 王s

本文編號：328719