目的制備并鑒定羊駝來源的高特異性、高親和力的抗人轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）的納米抗體。方法構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒并瞬時轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細(xì)胞HEK-293T,獲得重組TGF-β1蛋白;用該蛋白混合弗氏佐劑免疫羊駝,分離外周血單核細(xì)胞,提取RNA進(jìn)行巢式PCR,擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)（VHH）,并構(gòu)建VHH噬菌體展示文庫;利用ELISA篩選能與TGF-β1重組蛋白特異性結(jié)合的抗體株,原核表達(dá)并純化抗TGF-β1的納米抗體;利用免疫印跡、免疫熒光和ForteBio Octer?等方法鑒定納米抗體的特異性及親和力。結(jié)果成功構(gòu)建cFUGW-TGF-β1表達(dá)載體并純化了3 mg TGF-β1蛋白;羊駝經(jīng)過5次免疫后得到容量為1.2×10⁸的TGF-β1-VHH噬菌體展示文庫;通過4輪ELISA篩選,得到7株能與重組TGF-β1蛋白特異性結(jié)合的抗體株;免疫印跡及免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示原核表達(dá)純化的TGF-β1納米抗體B3和C8能特異性識別肺癌細(xì)胞系NCI-H520表達(dá)的天然TGF-β1;ForteBio Octer?結(jié)果顯示B3、C8與重組TGF-β1的親和力分別達(dá)到1.48×10... 

【文章來源】：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床. 2020,40(05)CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

重組TGF-β1的純化與鑒定

經(jīng)PCR擴(kuò)增的人TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)全長DNA序列,長度為1 188 bp(圖1A);雙酶切鑒定顯示3 518 bp和6 895 bp的兩條條帶(圖1B),提示cFUGW-TGF-β1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2 重組TGF-β1蛋白的表達(dá)純化及鑒定

ELLSA檢測隨機(jī)挑選的21株克隆與重組TGF-β1蛋白的結(jié)合情況,篩選得到B3、C5、C8、F4、F6、G6和G8,7株陽性克隆(圖5)。圖3 重組TGF-β1的純化與鑒定


本文編號：3284836