目的建立一種基于重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RAA）的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)核酸檢測(cè)方法。方法針對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)12S rRNA基因序列片段,設(shè)計(jì)、篩選并合成RAA特異性擴(kuò)增引物和熒光檢測(cè)探針,構(gòu)建細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)熒光RAA檢測(cè)方法。分別以含靶序列的不同拷貝數(shù)重組質(zhì)粒和不同濃度細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增,評(píng)價(jià)其檢測(cè)靈敏度;分別以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)、多房棘球絳蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)、曼氏血吸蟲(chóng)、十二指腸鉤蟲(chóng)、華支睪吸蟲(chóng)、牛帶絳蟲(chóng)、曼氏迭宮絳蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增,評(píng)價(jià)其檢測(cè)特異性。結(jié)果成功建立了細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)熒光RAA檢測(cè)法,在39℃條件下20 min內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因組DNA特異性擴(kuò)增,最低可以檢測(cè)出10拷貝/μL含靶序列的重組質(zhì)粒DN A和0.1 ng/μL細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因組DN A樣本,具備較高敏感性;對(duì)多房棘球絳蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)、曼氏血吸蟲(chóng)、十二指腸鉤蟲(chóng)、華支睪吸蟲(chóng)、牛帶絳蟲(chóng)、曼氏迭宮絳蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)基因組DNA均無(wú)陽(yáng)性擴(kuò)增,具備較高特異性;且該熒光RAA法可成功檢出細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)包囊中DNA。結(jié)論成功建立了一種快速、靈敏、特異的可用于細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)核酸檢測(cè)的熒光R... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志. 2020,32(04)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

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熒光RAA法檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)包囊DNA樣本FigFig.2FluorescentRAAassayfordetectionofDNAsamplesfromEE.granulosuscysts

中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志2020年第32卷第4期ChinJSchistoControl2020，Vol.32，No.4間逐漸延長(zhǎng)（K值依次為6732、3837、1075、116）。本次實(shí)驗(yàn)最低可檢測(cè)到含有10拷貝/μL重組質(zhì)粒的熒光信號(hào)（圖3）。采用熒光RAA法檢測(cè)不同濃度細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因組DNA樣本。結(jié)果顯示，除陰性對(duì)照外，濃度分別為10、1、0.1ng/μL的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因組DNA樣本均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增（K值分別為7186、1675、296），檢測(cè)敏感性可達(dá)0.1ng/μL基因組DNA（圖4）。圖3以不同拷貝數(shù)重組質(zhì)粒為模板的熒光RAA法檢測(cè)敏感性FigFig.3SensitivityoffluorescentRAAassayusingvariouscopynumbersofrecombinantplasmidsastemplates圖4以不同濃度細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因組DNA為模板的熒光RAA法檢測(cè)敏感性FigFig.4SensitivityoffluorescentRAAassayusingdifferentconcentrationsofEE.granulosusgenomicDNAsamplesastemplates4熒光RAA法檢測(cè)特異性分別以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)包囊、多房棘球絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵、曼氏血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵、十二指腸鉤蚴培養(yǎng)物、華支睪吸蟲(chóng)囊蚴、牛帶絳蟲(chóng)孕節(jié)、曼氏迭宮絳蟲(chóng)孕節(jié)、豬帶絳蟲(chóng)孕節(jié)基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增，結(jié)果顯示，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)包囊DNA存在陽(yáng)性擴(kuò)增（K值為657），其他樣本擴(kuò)增結(jié)果均為陰性（圖5）。圖5熒光RAA法檢測(cè)特異性Figig.5SpecificityoffluorescentRAAassay討論棘球蚴病在我國(guó)中西北部地區(qū)仍存在較大范圍流行，嚴(yán)重威脅著流行區(qū)人民群眾身體健康和生活水平［13］；同時(shí)，隨著西部牛羊等大量流入東部地區(qū)，也給當(dāng)?shù)貛?lái)了一定的棘球蚴病傳播風(fēng)險(xiǎn)［1

吸蟲(chóng)病防治雜志2020年第32卷第4期ChinJSchistoControl2020，Vol.32，No.4間逐漸延長(zhǎng)（K值依次為6732、3837、1075、116）。本次實(shí)驗(yàn)最低可檢測(cè)到含有10拷貝/μL重組質(zhì)粒的熒光信號(hào)（圖3）。采用熒光RAA法檢測(cè)不同濃度細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因組DNA樣本。結(jié)果顯示，除陰性對(duì)照外，濃度分別為10、1、0.1ng/μL的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因組DNA樣本均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增（K值分別為7186、1675、296），檢測(cè)敏感性可達(dá)0.1ng/μL基因組DNA（圖4）。圖3以不同拷貝數(shù)重組質(zhì)粒為模板的熒光RAA法檢測(cè)敏感性FigFig.3SensitivityoffluorescentRAAassayusingvariouscopynumbersofrecombinantplasmidsastemplates圖4以不同濃度細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因組DNA為模板的熒光RAA法檢測(cè)敏感性FigFig.4SensitivityoffluorescentRAAassayusingdifferentconcentrationsofEE.granulosusgenomicDNAsamplesastemplates4熒光RAA法檢測(cè)特異性分別以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)包囊、多房棘球絳蟲(chóng)幼蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵、曼氏血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵、十二指腸鉤蚴培養(yǎng)物、華支睪吸蟲(chóng)囊蚴、牛帶絳蟲(chóng)孕節(jié)、曼氏迭宮絳蟲(chóng)孕節(jié)、豬帶絳蟲(chóng)孕節(jié)基因組DNA為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增，結(jié)果顯示，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)包囊DNA存在陽(yáng)性擴(kuò)增（K值為657），其他樣本擴(kuò)增結(jié)果均為陰性（圖5）。圖5熒光RAA法檢測(cè)特異性Figig.5SpecificityoffluorescentRAAassay討論棘球蚴病在我國(guó)中西北部地區(qū)仍存在較大范圍流行，嚴(yán)重威脅著流行區(qū)人民群眾身體健康和生活水平［13］；同時(shí)，隨著西部牛羊等大量流入東部地區(qū)，也給當(dāng)?shù)貛?lái)了一定的棘球蚴病傳播風(fēng)險(xiǎn)［14］

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2011-2018年宜興市棘球蚴病監(jiān)測(cè)[J]. 梁靜,薛志強(qiáng),李學(xué)兵,孫旭峰.  中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志. 2019(06)
[2]重組酶介導(dǎo)的華支睪吸蟲(chóng)特異性核酸等溫?cái)U(kuò)增方法的建立及初步評(píng)價(jià)[J]. 張強(qiáng),丁昕,吳小珉,劉燕紅,劉劍峰,徐祥珍,應(yīng)清界,曹俊,戴洋.  中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志. 2019(05)
[3]重組酶介導(dǎo)的隱孢子蟲(chóng)屬特異性等溫核酸擴(kuò)增方法的建立及評(píng)價(jià)[J]. 倪碧嫻,吳小珉,劉燕紅,徐祥珍,應(yīng)清界,曹俊,戴洋.  中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志. 2019(04)
[4]重組酶介導(dǎo)的核酸等溫?cái)U(kuò)增熒光法快速檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)感染性釘螺[J]. 李婷,劉燕紅,趙松,熊春蓉,董萱,張鍵鋒,李偉,應(yīng)清界,楊坤.  中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志. 2019(02)
[5]等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在寄生蟲(chóng)及其他病原體檢測(cè)中的應(yīng)用[J]. 李婷,楊坤.  中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志. 2018(02)
[6]牛羊包蟲(chóng)病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 孫雨,王曉英,董浩,曲萍,胡冬梅,趙柏林,石慧,宋曉暉.  中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué). 2016(01)
[7]我國(guó)主要?jiǎng)游镌葱约纳x(chóng)病檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 蓋文燕,王君瑋,王娟,曲志娜,黃秀梅,李玉清,洪軍.  中國(guó)動(dòng)物檢疫. 2013(12)
[8]包蟲(chóng)病診斷技術(shù)與預(yù)防疫苗的研究進(jìn)展[J]. 趙莉,張旭,張壯志,馬正海,古努爾·吐?tīng)栠d,張文寶,石保新.  疾病預(yù)防控制通報(bào). 2013(02)
[9]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)DNA的初步研究[J]. 徐祥珍,金小林,李健,江文才,蔣崗.  中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志. 2011(05)



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