CXC趨化因子受體2（the CXC chemokine receptor 2,CXCR2）介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化在細(xì)菌感染、慢性炎癥、腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,但是目前對于CXCR2受體及下游信號的調(diào)控并未被完全揭示。該研究首先以Flag-CXCR2-Tango質(zhì)粒為模板設(shè)計Flag-CXCR2的特異性引物,PCR擴(kuò)增后將其連接至pCDH-MCS-T2A-Neo-MSCV慢病毒表達(dá)載體上,隨后對陽性克隆進(jìn)行測序及表達(dá)驗證。接著在HEK-293T細(xì)胞中包裝過表達(dá)Flag-CXCR2的慢病毒顆粒并感染HEK-293細(xì)胞,使用遺傳霉素篩選后,蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),Flag-CXCR2穩(wěn)定表達(dá)在HEK-293細(xì)胞膜上。最后利用白細(xì)胞介素-8（interleukin-8,IL-8）刺激過表達(dá)Flag-CXCR2的細(xì)胞株,檢測發(fā)現(xiàn)CXCR2下游信號通路活化及F-actin組裝。 

【文章來源】：中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報. 2020,42(08)CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

穩(wěn)定過表達(dá)Flag-CXCR2的HEK-293細(xì)胞株的活性鑒定

CXCR2作為膜受體,在靜息狀態(tài)下定位于細(xì)胞膜。本實驗將對照和表達(dá)Flag-CXCR2的細(xì)胞株進(jìn)行免疫熒光檢測。結(jié)果顯示,穩(wěn)定表達(dá)Flag-CXCR2受體的細(xì)胞株在細(xì)胞膜上能夠明顯看到綠光,而對照組則無綠光,這表明Flag-CXCR2蛋白成功定位細(xì)胞膜(圖3B)。2.4 穩(wěn)定過表達(dá)Flag-CXCR2的HEK-293細(xì)胞株的活性鑒定

CXCR2受體與配體結(jié)合后,一方面能夠?qū)е翽I3K-AKT以及MAPK信號通路的活化,另一方面能夠促使F-actin發(fā)生極化,為細(xì)胞運動做準(zhǔn)備。本實驗將對照和穩(wěn)定過表達(dá)Flag-CXCR2的細(xì)胞株進(jìn)行IL-8刺激。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Flag-CXCR2受體的細(xì)胞株中p-JNK、p-P38、p-AKT在IL-8刺激短時間內(nèi)活化明顯增強(qiáng);但在刺激后15 min時,活化現(xiàn)象消失(圖4A)。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),在IL-8刺激30 s時,過表達(dá)Flag-CXCR2受體細(xì)胞株F-actin瞬間發(fā)生極化且明顯高于對照組,隨著時間的增加,其F-actin極化逐漸減少,直到恢復(fù)到靜息狀態(tài)(圖4B)。CXCR2是重要的趨化受體,能夠響應(yīng)IL-8的刺激,促使細(xì)胞發(fā)生趨化。本實驗將對照和表達(dá)Flag-CXCR2的細(xì)胞株進(jìn)行Transwell實驗。結(jié)果顯示,穩(wěn)定表達(dá)Flag-CXCR2受體的細(xì)胞株趨化能力增強(qiáng),發(fā)生趨化的細(xì)胞明顯多于對照組,這表明Flag-CXCR2蛋白成功介導(dǎo)細(xì)胞趨化(圖4C)。以上結(jié)果表明,穩(wěn)定過表達(dá)Flag-CXCR2的HEK-293細(xì)胞株能夠良好響應(yīng)配體刺激。圖3 HEK-293細(xì)胞株中Flag-CXCR2的表達(dá)與定位

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CXCR2蛋白在結(jié)腸腺癌組織中的表達(dá)及意義[J]. 劉鴻章,劉力,周超熙,李欣慧,侯敏,張剛,劉超,張濤,賈雄杰,林坤峰,劉曉銳,張愛民,趙繼東,張香梅.  廣東醫(yī)學(xué). 2019(23)
[2]IL-8及CXCR1、CXCR2在白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)及其意義[J]. 程麗娜,宋蔚,閆春妮.  現(xiàn)代醫(yī)學(xué). 2019(10)
[3]肌萎縮側(cè)索硬化患者外周血中IL-8、CXCR1、CXCR2的表達(dá)及意義[J]. 蘇丹丹,張勇,畢方方,肖波.  中國臨床研究. 2019(10)
[4]CXCL8及其受體CXCR1、CXCR2在慢性乙肝中的表達(dá)及意義[J]. 劉欣燕,王宏飛.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2018(09)
[5]G蛋白偶聯(lián)受體的探索之路—記2012年諾貝爾化學(xué)獎得主Robert J.Lefkowitz和Brian K.Kobilka[J]. 肖晗,張幼怡.  中國科學(xué):生命科學(xué). 2012(12)



本文編號：3143018