目的（1）探討miR-219a-5p在etoposide損傷及H₂O₂損傷細(xì)胞模型中的表達(dá)情況;（2）利用生物信息學(xué)篩選出CCNA2和CACUL1是miR-219a-5p的靶蛋白,并探討蛋白CCNA2和CACUL1在etoposide損傷及H₂O₂損傷模型中的變化趨勢(shì);（3）驗(yàn)證蛋白CCNA2和CACUL1是miR-219a-5p的靶蛋白;（4）探尋特異變化的miR-219a-5p在TBI過程中的作用機(jī)制,以期為TBI患者的診斷和治療提供新思路與新方法。方法（1）采用25μmol/L etoposide刺激損傷神經(jīng)元細(xì)胞,并收集在1h,6h,16h,20h,24h時(shí)損傷的神經(jīng)元細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的總RNA。另外,采用150μmol/L H₂O₂損傷神經(jīng)元細(xì)胞,并提取在6h,12h,18h,24h時(shí)損傷的神經(jīng)元細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)的總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative Real-time polymerase chain reac... 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

pMIR-REPORT熒光素酶質(zhì)粒示意圖

17圖 2-2 β-半乳糖苷酶表達(dá)質(zhì)粒示意圖經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)或抑制實(shí)驗(yàn)研究 miR-219a-5p 與靶基因 CCNA2 和 CACUL1 的關(guān)系，我們通過ctamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染 miR-219a-5p agomir 和 antagomir 及其對(duì)照司合成）的方法，人為過表達(dá)或者降低 miR-219a-5p 在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的miR-219a-5p agomir 是根據(jù) miR-219a-5p 成熟體序列設(shè)計(jì)的雙鏈用于模擬內(nèi)源性成熟體 miR-219a-5p 序列，從而上調(diào) miR-219a-5p19a-5p antagomir 是根據(jù) miR-219a-5p 成熟體序列設(shè)計(jì)的一段反義，用于抑制細(xì)胞內(nèi) miR-219a-5p 的活性。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟如下

實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的鑒定原代皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)體外培養(yǎng)大約 3 天后，呈紡錘形，部分呈橢圓形或三角形，樹突和軸突明顯；培養(yǎng)第七天時(shí)，胞體遮光性強(qiáng)、立體感好，形態(tài)飽滿，樹突軸突更豐富，相互交織成網(wǎng)絡(luò)狀。為了鑒定皮質(zhì)神經(jīng)元的純度，我們采用 MAP2抗體進(jìn)行了免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)。熒光顯微鏡結(jié)果顯示呈綠色熒光的部位是神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)和樹突，表示 MAP2 蛋白表達(dá)陽性。DAPI 可與雙鏈 DNA 結(jié)合，陽性表現(xiàn)為細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光；計(jì)算同一視野下 DAPI 染色陽性的細(xì)胞中 MAP2 也呈陽性的神經(jīng)元所占的百分比，結(jié)果顯示：MAP2 和 DAPI 雙染色均為陽性的神經(jīng)元所占百分比達(dá) 95%以上，說明所培養(yǎng)的原代神經(jīng)元純化良好。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Toll樣受體4信號(hào)通路研究進(jìn)展[J]. 蔡炳岡,朱進(jìn),汪茂榮.  醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào). 2015(11)
[2]脂質(zhì)相關(guān)miRNA研究進(jìn)展[J]. 劉婷,王靜,汪俊軍.  臨床檢驗(yàn)雜志. 2014(07)



本文編號(hào)：3044777