HOXB6在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,但在人胚胎干細胞中胚層分化中的作用尚不清楚。該研究利用人胚胎干細胞中胚層分化模型結(jié)合RNA-seq分析發(fā)現(xiàn),HOXB6在中胚層分化過程中顯著上調(diào),敲降HOXB6的表達抑制人胚胎干細胞向中胚層分化,提示HOXB6在中胚層分化過程中發(fā)揮功能。通過建立HOXB6誘導(dǎo)性過表達的人胚胎干細胞株發(fā)現(xiàn),HOXB6過表達抑制人胚胎干細胞多能性標(biāo)志分子的表達,并且顯著上調(diào)中胚層標(biāo)志分子的表達。該研究表明,HOXB6單獨過表達能夠啟動人胚胎干細胞向中胚層分化,為理解人類早期發(fā)育和建立人胚胎干細胞高效誘導(dǎo)分化體系提供了理論依據(jù)。 

【文章來源】：中國細胞生物學(xué)學(xué)報. 2020,42(06)

【文章頁數(shù)】：10 頁

【部分圖文】：

HOXB6在人胚胎干細胞向中胚層分化過程中表達顯著上調(diào)

為了探究HOXB6過表達對人胚胎干細胞的影響,我們在人胚胎干細胞自我更新培養(yǎng)條件下,在構(gòu)建好的HOXB6誘導(dǎo)性過表達人胚胎干細胞株中添加DOX誘導(dǎo)HOXB6的過表達。如圖3A所示,形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)過表達HOXB6 72 h后人胚胎干細胞的形態(tài)發(fā)生明顯變化,從緊密規(guī)則的克隆樣變成疏松扁平的間質(zhì)樣細胞,提示HOXB6過表達促使人胚胎干細胞多能性丟失。因此,我們利用qRT-PCR檢測細胞添加DOX誘導(dǎo)HOXB6過表達72 h后多能性標(biāo)志基因和中、外、內(nèi)三個不同胚層各自標(biāo)志基因的表達變化。結(jié)果顯示,添加DOX可以誘導(dǎo)HOXB6的表達(圖3B),且HOXB6過表達使多能性標(biāo)志基因NANOG、POU5F1的表達顯著降低(圖3C),證實HOXB6過表達促使人胚胎干細胞喪失多能性。為了驗證過表達HOXB6后人胚胎干細胞具體向哪一胚層分化,我們進行qRT-PCR檢測人胚胎干細胞過表達HOXB6 72 h后中、外、內(nèi)三個不同胚層各自標(biāo)志基因的表達情況。如圖3D所示,HOXB6過表達顯著誘導(dǎo)中胚層標(biāo)志基因T、MIXL1、EOMES的表達,而對內(nèi)胚層和外胚層的標(biāo)志基因的表達并無顯著影響,說明HOXB6過表達可以啟動中胚層分化。免疫熒光實驗同樣表明,在人胚胎干細胞中添加DOX誘導(dǎo)HOXB6過表達導(dǎo)致多能性基因NANOG和OCT4的蛋白表達下降,中胚層標(biāo)志分子T和MIXL1的蛋白表達增高(圖3E和圖3F)。以上結(jié)果表明,HOXB6單獨過表達促使人胚胎干細胞喪失多能性,啟動中胚層分化。3 討論

本研究利用人胚胎干細胞中胚層分化模型結(jié)合RNA-seq分析發(fā)現(xiàn),HOXB6在中胚層誘導(dǎo)分化過程中顯著上調(diào)。為了探究HOXB6在中胚層分化過程中的作用,我們利用shRNA在人胚胎干細胞中敲降HOXB6,發(fā)現(xiàn)敲降HOXB6抑制人胚胎干細胞向中胚層分化,提示HOXB6在人胚胎干細胞中胚層分化過程中發(fā)揮重要作用。為了進一步探究HOXB6的功能,本研究利用Tet-on DOX誘導(dǎo)系統(tǒng)建立了HOXB6誘導(dǎo)性過表達的人胚胎干細胞株。通過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),HOXB6過表達使人胚胎干細胞由緊密規(guī)則的克隆樣變成疏松扁平的間質(zhì)樣細胞,qRT-PCR和免疫熒光實驗證實,HOXB6過表達使人胚胎干細胞多能性標(biāo)志基因的表達下降,而中胚層特異性標(biāo)志基因的表達上升。這些結(jié)果表明,HOXB6過表達促使人胚胎干細胞退出多能性,啟動中胚層分化。中胚層是胚胎發(fā)育早期間隔于外胚層和內(nèi)胚層之間的結(jié)構(gòu),是形成各種組織的細胞來源,包括心臟、血管系統(tǒng)和血液系統(tǒng)等,解析人胚胎干細胞向中胚層分化的調(diào)控機制對于人體發(fā)育研究及組織器官再生均具有重要意義[18-19]。利用人胚胎干細胞中胚層分化體系,我們之前鑒定到中胚層發(fā)生的核心調(diào)控因子MSX2[7]。為了進一步鑒定中胚層發(fā)生的調(diào)控因子,本研究利用人胚胎干細胞中胚層分化模型結(jié)合RNA-seq分析,發(fā)現(xiàn)了HOXB家族基因在中胚層誘導(dǎo)分化過程中顯著上調(diào)。2006年,IIMURA等[20]發(fā)現(xiàn),在雞胚發(fā)育早期Hoxb基因的共線激活導(dǎo)致外胚層前體遷移到原條中進行中胚層特化,并且在青蛙和小鼠胚胎中也觀察到類似的Hoxb基因的共線激活,表明該研究在脊椎動物中是保守的。2016年,DENG等[13]在小鼠胚胎干細胞的研究中發(fā)現(xiàn)了Hoxb位點相關(guān)的lincRNA-HoxBlinc RNA通過調(diào)節(jié)局部染色質(zhì)的改變來調(diào)節(jié)Hoxb基因的轉(zhuǎn)錄,并且通過Wnt/NOTCH信號通路和Hox通路調(diào)控心源性/血源性中胚層分化,當(dāng)HoxBlinc RNA受到抑制時,中胚層衍生受到干擾,導(dǎo)致早期細胞譜系的阻滯。這些研究表明,HOXB家族基因在中胚層發(fā)育中發(fā)揮作用。2000年,LOWE等[14]利用Hoxb6-cre轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)Hoxb6在小鼠中胚層中也有顯著表達。然而,HOXB6在中胚層分化中的作用尚不清楚。本研究揭示了在人胚胎干細胞中敲降HOXB6會抑制中胚層分化,并且HOXB6過表達促使人胚胎干細胞退出多能性,啟動人胚胎干細胞向中胚層分化。該研究證實,HOXB6是人胚胎干細胞向中胚層分化的重要調(diào)控分子,但是就HOXB6是通過何種機理調(diào)控中胚層發(fā)生而言還需要進一步的研究。


本文編號：3025532