朊蛋白對細(xì)胞生長及炎癥反應(yīng)的影響
發(fā)布時(shí)間：2021-01-30 10:14
朊蛋白（Prion protein,PrP）是位于細(xì)胞膜表面的糖蛋白,由PRNP基因所編碼的253個(gè)氨基酸組成,在機(jī)體內(nèi)多個(gè)組織和器官中廣泛表達(dá),其構(gòu)象錯(cuò)構(gòu)則會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袀魅拘缘碾貌《?PrPSC)。既往對朊病毒在傳播途徑和致病機(jī)理等方面已有了較深入的研究,但對朊蛋白的正常生理功能則所知甚少,而在神經(jīng)系統(tǒng)以外的功能則更不明了。本研究通過利用CRISPR-Cas9和慢病毒載體的RNAi技術(shù)對不同細(xì)胞系（人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29以及人淋巴瘤細(xì)胞系U937）的PrP表達(dá)量進(jìn)行敲除/敲低來探究PrP對于細(xì)胞的生長和炎癥反應(yīng)的影響,在分子水平上研究PrP的生理功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,通過CRISPR-Cas9和慢病毒載體的RNAi技術(shù)所構(gòu)建的不同細(xì)胞系的PrP表達(dá)量在WB檢測時(shí)均顯著低于對照組,證明我們成功構(gòu)建了PrP的敲低/敲除細(xì)胞系,包括HT29-PrP-/-系,HT29-siPrP系和U937-siPrP系。之后我們對三種細(xì)胞系進(jìn)行了生長及炎癥反應(yīng)的研究。MTT結(jié)果顯示PrP表達(dá)量的降低引起了三種細(xì)胞系生長增殖速度的變慢�？紤]到U937作為淋巴瘤細(xì)胞...
【文章來源】：華東師范大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：97 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
Guide#1在PRNP基因中的位置
圖 3.2pSpCas9(BB)-2A-Puro 質(zhì)粒的關(guān)鍵信息。圖中左側(cè)第 個(gè)紅框所標(biāo)記的是 U6 啟區(qū)域，在的 SgRNA 序列的整合區(qū)域之前，是測序的起始序列；第二個(gè)紅框?yàn)?SgRNA 序列的整合域；紫色區(qū)域?yàn)?Cas9 蛋白的序列；第三個(gè)紅框?yàn)樗幬锖Y選位點(diǎn)。Fig.3.2 The key site of pSpCas9(BB)-2A-Puro plasmid. The first red box on thof the figure marks the U6 promoter region, which is the starting sequence for sequencing beforeintegration region of our SgRNA sequence; the second red box is the integrated region of the SgRsequence; the purple region isThe sequence of the Cas9 protein; the third red box is our drug screening將最終抽提出來的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切和雙酶切驗(yàn)證后，對比其酶切后分子小與 DNAMarker 的位置，所出現(xiàn)的條帶大小與報(bào)道的質(zhì)粒的大小相符合，需進(jìn) 步確定設(shè)計(jì)的 SgRNA 是否整合到質(zhì)粒中，以確定其為我們所需要的其電泳結(jié)果如下圖所示：
圖 3.3 質(zhì)粒酶切后的電泳結(jié)果。圖中第 泳道為Marker，第二泳道為酶切對照組，第三泳道為 Apal 酶切組，第四泳道為 Xbal 酶切組，第五泳道為 Apal 和 Xbal 的雙酶切組，第六泳道為質(zhì)粒原溶液組。Fig.3.3 The result of plasmid Enzyme digestion. In the figure, the first lane is Marker,the second lane is the enzyme digestion control group, the third lane isApal digestion group, the fourth laneis Xbal digestion group, and the fifth lane isApal and Xbal ,the sixth lane is the plasmid stock group.為了進(jìn) 步確定設(shè)計(jì)的 SgRNA 是否整合到質(zhì)粒中，再將該質(zhì)粒送往公司進(jìn)行測序，檢測所設(shè)計(jì)的 SgRNA 是否有效地整合到了該質(zhì)粒之中。對公司所反饋的測序結(jié)果與我們所設(shè)計(jì)的 SgRNA 進(jìn)行比對，其對比的測序結(jié)果如下圖所示：
【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]朊蛋白在LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥中的作用研究[D]. 王慶文.華東師范大學(xué) 2018
[2]內(nèi)源性朊蛋白在結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌中的作用的研究[D]. 鞏昌國.華東師范大學(xué) 2016
本文編號(hào)：3008720
【文章來源】：華東師范大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：97 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
Guide#1在PRNP基因中的位置
圖 3.2pSpCas9(BB)-2A-Puro 質(zhì)粒的關(guān)鍵信息。圖中左側(cè)第 個(gè)紅框所標(biāo)記的是 U6 啟區(qū)域，在的 SgRNA 序列的整合區(qū)域之前，是測序的起始序列；第二個(gè)紅框?yàn)?SgRNA 序列的整合域；紫色區(qū)域?yàn)?Cas9 蛋白的序列；第三個(gè)紅框?yàn)樗幬锖Y選位點(diǎn)。Fig.3.2 The key site of pSpCas9(BB)-2A-Puro plasmid. The first red box on thof the figure marks the U6 promoter region, which is the starting sequence for sequencing beforeintegration region of our SgRNA sequence; the second red box is the integrated region of the SgRsequence; the purple region isThe sequence of the Cas9 protein; the third red box is our drug screening將最終抽提出來的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切和雙酶切驗(yàn)證后，對比其酶切后分子小與 DNAMarker 的位置，所出現(xiàn)的條帶大小與報(bào)道的質(zhì)粒的大小相符合，需進(jìn) 步確定設(shè)計(jì)的 SgRNA 是否整合到質(zhì)粒中，以確定其為我們所需要的其電泳結(jié)果如下圖所示：
圖 3.3 質(zhì)粒酶切后的電泳結(jié)果。圖中第 泳道為Marker，第二泳道為酶切對照組，第三泳道為 Apal 酶切組，第四泳道為 Xbal 酶切組，第五泳道為 Apal 和 Xbal 的雙酶切組，第六泳道為質(zhì)粒原溶液組。Fig.3.3 The result of plasmid Enzyme digestion. In the figure, the first lane is Marker,the second lane is the enzyme digestion control group, the third lane isApal digestion group, the fourth laneis Xbal digestion group, and the fifth lane isApal and Xbal ,the sixth lane is the plasmid stock group.為了進(jìn) 步確定設(shè)計(jì)的 SgRNA 是否整合到質(zhì)粒中，再將該質(zhì)粒送往公司進(jìn)行測序，檢測所設(shè)計(jì)的 SgRNA 是否有效地整合到了該質(zhì)粒之中。對公司所反饋的測序結(jié)果與我們所設(shè)計(jì)的 SgRNA 進(jìn)行比對，其對比的測序結(jié)果如下圖所示：
【參考文獻(xiàn)】：
碩士論文
[1]朊蛋白在LPS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥中的作用研究[D]. 王慶文.華東師范大學(xué) 2018
[2]內(nèi)源性朊蛋白在結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌中的作用的研究[D]. 鞏昌國.華東師范大學(xué) 2016
本文編號(hào)：3008720
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