目的:篩選特異性抗人載脂蛋白6單鏈抗體（anti-hLCN6 scFv）,并進(jìn)行表達(dá)純化和活性鑒定。方法:采用RT-PCR技術(shù),用抗體可變區(qū)簡(jiǎn)并引物,從hLCN6免疫小鼠的淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增全套V_H和V_L基因,裝配成scFv基因后將其克隆到噬菌體載體pFAB5C中,構(gòu)建scFv噬菌體抗體庫(kù)。對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行4輪富集,篩選抗hLCN6陽(yáng)性scFv。經(jīng)原核表達(dá)純化后,用Western blot和間接ELISA對(duì)其活性進(jìn)行鑒定。結(jié)果:篩選到2株親和力較高的陽(yáng)性克隆,測(cè)序表明其序列一致。獲得了高純度的scFv抗體,其對(duì)抗原具有良好的親和力和特異性。結(jié)論:成功篩選到特異性抗hLCN6 scFv,為利用該抗體進(jìn)行混合斑中的精子分離奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)免疫學(xué)雜志. 2020,36(10)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

抗hLCN6 scFv親和力測(cè)定

將全套VH、VL基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳后,擴(kuò)增出的VH基因片段約為340 bp,VL基因片段約為320 bp,與預(yù)期大小一致 (圖1A)。將全套VH、VL基因添加酶切位點(diǎn)及連接肽序列后,用重疊延伸PCR將重、輕鏈可變區(qū)拼接成完整的scFv基因,拼接擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后,得到1條約710 bp的片段,同預(yù)期結(jié)果相符 (圖1B)。將拼接產(chǎn)物雙酶切后與載體連接,轉(zhuǎn)化E.coli后鋪板,測(cè)定庫(kù)容為1.5×106,隨機(jī)挑取10個(gè)集落,PCR擴(kuò)增鑒定重組率為90% (圖1C)。2.2 噬菌體抗體庫(kù)的篩選及陽(yáng)性克隆的鑒定

表1 親和富集篩選對(duì)抗hLCN6 scFv的富集效應(yīng)Tab.1 Selective enrichment of anti-hLCN6 phage antibodies from phage display library Round Input(cfu) Output(cfu) Recovery rate(output/input) Enrichment[rate(n)/rate(1)] 1 1.0×1013 2.5×105 2.5×10-8 1 2 1.5×1012 2.0×106 1.3×10-6 52 3 2.0×1012 3.8×107 1.9×10-5 760 4 2.4×1012 7.9×107 3.3×10-5 1 3202.3 抗hLCN6 scFv的表達(dá)純化與生物學(xué)活性鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]hLCN6單克隆抗體偶聯(lián)免疫磁珠用于混合細(xì)胞中精子的分離與法醫(yī)學(xué)鑒定[J]. 陳炯,馮巍,詹飛.  生物工程學(xué)報(bào). 2019(01)
[2]單鏈抗體的構(gòu)建及其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用[J]. 汪希雅,余平.  中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2009(10)
[3]單鏈抗體及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J]. 馬穎,鄒全明.  免疫學(xué)雜志. 2006(S1)
[4]抗p185單抗5E12Fab段基因的克隆及表達(dá)[J]. 張國(guó)民,陳宇萍,王琰,喬媛媛,安云慶.  中國(guó)免疫學(xué)雜志. 2005(12)



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