目的建立Sprague Dawley （SD）大鼠的正常膝關(guān)節(jié)滑膜細胞原代培養(yǎng)方法及脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）誘導成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）炎癥模型。方法選取80～120 g SPF級幼年SD大鼠,分離其滑膜組織,原代培養(yǎng)至第3代,用組織化學染色法和Ed U法檢測FLS蛋白標志物vimentin和增殖功能。同時,用滑膜組織作對照,檢測第3代至第8代原代培養(yǎng)FLS的特征蛋白表達,篩選具有生理功能的高純度且可用于后續(xù)實驗的FLS細胞。LPS誘導FLS炎癥后,檢測LPS制激FLS不同時間點的IL-1β和TNF-α的mRNA和蛋白表達,根據(jù)實驗結(jié)果確定LPS成功誘導FLS炎癥模型的時間點。最后,檢測FLS被LPS誘導前后的細胞因子、增殖功能和特征蛋白的表達,為分析FLS炎癥模型提供實驗數(shù)據(jù)。結(jié)果采用0.2%I型膠原酶消化法,成功培養(yǎng)了FLS原代細胞。經(jīng)檢測蛋白標志物vimentin,第3代FLS純度達98%以上。通過FLS特征蛋白檢測,篩選出具有生理功能且可用作后續(xù)實驗的FLS為第3代至第7代原代細胞。通過... 

【文章來源】：中國實驗動物學報. 2020年04期 北大核心

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SD大鼠正�；ぜ毎囵B(yǎng)及其鑒定

建立實驗動物的體內(nèi)和體外模型，目的都是為了更好地研究疾病的發(fā)病機制、治療方法及其效果評價，但動物的選擇要根據(jù)實驗需要和研究目的來確定，同時還要兼顧實驗時間的長短、動物飼養(yǎng)成本的高低、操作難易程度等。為了研究RA的滑膜增生，陳芳等[16]改良了組織塊法，分離培養(yǎng)了兔膝關(guān)節(jié)FLS�；ぱ装Y是OA和RA等IJD的共同病理過程，其動物模型，應(yīng)選擇動物成熟期短，能滿足較短的實驗周期，且生存及抗感染能力較強的動物。據(jù)統(tǒng)計，目前1/4 OA動物模型選擇大鼠作為實驗動物[17]。大鼠模型能模擬人類IJD發(fā)病機制和病理過程，且具有操作方便易行、穩(wěn)定性高、干擾因素少等特性。本實驗不僅是建立滑膜FLS原代培養(yǎng)方法，更重要的是建立FLS炎癥模型，所以我們選擇了SPF級SD大鼠。建模獲得成功，為研究IJD提供了良好的實驗條件。在OA和RA等IJD中，由于可溶活性因子和細胞表面的相互作用激活FLS，合成并釋放促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α等，激活免疫系統(tǒng)，從免疫防御轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咂茐�，破壞關(guān)節(jié)，改變關(guān)節(jié)正常功能[18]。越來越多的研究[19]顯示:IJD滑液促炎因子分泌增加，滑膜明顯增厚，其FLS異常增殖和侵襲。IJD中潤滑素水平降低，透明質(zhì)酸分子的數(shù)量下降，滑液的潤滑能力也下降，增高了磷脂水平，脂肪鏈變短，不能有效減輕關(guān)節(jié)活動的摩擦力[20]。促炎因子在炎癥模型的高表達，是模擬炎癥病理狀態(tài)的關(guān)鍵。尤欣等[21]以hIL-1β為炎癥抗原誘導兔膝關(guān)節(jié)炎，檢測到關(guān)節(jié)滑膜組織hIL-1βmRNA的表達，滑膜組織呈結(jié)節(jié)樣增生，關(guān)節(jié)炎的嚴重程度與注入關(guān)節(jié)腔的MFG hIL-1β轉(zhuǎn)染兔滑膜細胞數(shù)目成正相關(guān)。熊樂等[22]向大鼠坐骨神經(jīng)斷端顯微注射LPS(2 g/L)1μL，術(shù)后1.5 h和24 h的IL-1βmRNA和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)mRNA的表達明顯升高。運用LPS誘導乳腺炎模型[12]，導致IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子釋放異常增加，加重炎癥。LPS作為炎癥抗原，LPS激活了固有的免疫系統(tǒng)，可通過細胞信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)激活單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、FLS、上皮細胞等合成和釋放多種細胞因子和炎性介質(zhì)，具有良好的一致性和重復性[12]。利用LPS制激FLS促進促炎因子的分泌，可以誘導出FLS的炎癥病理過程，LPS誘導的FLS炎癥模型，符合IJD的基本特征[20]。

IJD的主要特征是促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α高表達，通過一系列炎癥級聯(lián)反應(yīng)和激活各類信號通路，調(diào)節(jié)下游因子，促使IJD的發(fā)生和加劇，直至關(guān)節(jié)破壞。IJD的臨床癥狀是關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和關(guān)節(jié)殘廢[14]。軟骨降解在IJD的發(fā)病中起著重要作用，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路是軟骨降解的主要途徑。促炎因子是激活p38-MAPK信號通路的主要因素之一，MAPK信號通路的異常激活又可促進炎癥反應(yīng)，導致軟骨基質(zhì)降解酶的釋放，從而加速軟骨退化[23]。體外FLS炎癥模型的建立，對MAPK信號通路研究提供了工具。IL-1β是IJD首要致病因子之一，其可通過制激產(chǎn)生磷酸化的p38-MAPK來合成大量NO，反饋激活MAPK通路，促進IL-1β的產(chǎn)生，增加前列腺素E2及環(huán)氧化酶-2(COX-2)的水平，引起軟骨損傷。TNF-α可介導多種炎癥因子，可以與p38-MAPK形成正反饋環(huán)路，活化的p38-MAPK通路可促進TNF-α的表達，過度表達TNF-α可誘導軟骨細胞凋亡。這些促炎因子通過各種途徑激活信號通路，促使IJD的發(fā)生發(fā)展。NF-κB信號通路影響著OA、RA等IJD炎癥反應(yīng)的各個階段。NF-κB信號通路參與血管內(nèi)皮細胞黏附分子的表達并且與KOA患者淤血狀態(tài)密切相關(guān)。淤血和患處新生毛細血管是關(guān)節(jié)疼痛的重要因素。NF-κB信號通路也是軟骨降解進程中的關(guān)鍵分子途徑，其通過促進MMP-1、MMP-2、MMP-3等多種降解酶的分泌及COX-2、NO等分解代謝因子的合成，加劇關(guān)節(jié)炎軟骨的凋亡和軟骨的炎癥反應(yīng)[24]。TNF-α對FLS的增殖有促進作用，可使滑膜組織纖維樣變并增加滑液中的炎癥因子，加重病情。FLS還具有類似腫瘤細胞增殖的特性，可突破生理屏障侵入軟骨和骨，導致關(guān)節(jié)破壞。FLS入侵體參與FLS與軟骨的附著，其內(nèi)富含基質(zhì)金屬蛋白酶，可特異性地使細胞外基質(zhì)變性[25]。LPS既是炎癥抗原，又是NF-κB的激動劑，運用LPS誘導體外FLS炎癥模型的建立，有利于進行信號通路的干預，探討如何降低IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF和MMP等蛋白的表達，從而減弱或抑制住IJD誘導的疼痛和炎癥，延緩或阻止關(guān)節(jié)退變，達到治療的目的。圖5 熒光qRT-PCR法和Western Blot法檢測1000 ng/m L LPS制激FLS后不同時間點IL-1β和TNF-α的表達(n=5)

【參考文獻】：
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