質(zhì)粒是研究細(xì)菌、病毒和真核生物細(xì)胞內(nèi)遺傳信息和通路異質(zhì)性表達(dá)的有用工具。隨著分子生物學(xué)技術(shù)日益發(fā)展,已經(jīng)有許多方法可用于體外、體內(nèi)質(zhì)粒克�。ㄈ缑盖忻高B、PCR、體外重組以及體內(nèi)重組等）,甚至大片段克隆也不再是難題。常用的酶切法受限于酶切位點(diǎn)的存在與否及唯一性,添加酶切位點(diǎn)會(huì)引入的額外序列與DNA序列復(fù)雜性（如DNA片段過(guò)大、序列堿基分布及含量等）相關(guān)的擴(kuò)增困難,以及應(yīng)用于構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)時(shí)的操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)。重組技術(shù)一定程度上解決上述問(wèn)題。重組技術(shù)是一種基于核酸同源重組原理,利用噬菌體重組蛋白促進(jìn)寡核苷酸或線性DNA介導(dǎo)的體內(nèi)同源重組技術(shù),已廣泛應(yīng)用于質(zhì)粒、細(xì)菌人工染色體質(zhì)粒和多種原核生物基因組DNA的改造,包括堿基突變、缺失或插入。鑒于其重組效率相對(duì)較低,需要添加篩選標(biāo)記（如抗生素）來(lái)增加重組效率,而后去掉篩選標(biāo)記則需利用兩步法或引入序列特異性重組酶切除抗性標(biāo)簽（抗性基因兩邊有同向的兩個(gè)短的DNA序列可以被特定的重組酶識(shí)別）,切除后仍會(huì)留下一個(gè)短的能夠被重組酶識(shí)別的DNA序列,這種重組操作更復(fù)雜且耗時(shí)長(zhǎng),很難得到一個(gè)真正的無(wú)痕突變株。此外,重組質(zhì)粒形成多聚體形式或是同一細(xì)胞內(nèi)重組質(zhì)粒與親... 

【文章來(lái)源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖１重組的模型圖［６］??

意思的發(fā)現(xiàn)是ＣＲＩＳＰＲ序列中許多間隔序列是來(lái)源于質(zhì)粒和發(fā)現(xiàn)ＣＲＩＳＰＲ位點(diǎn)是可以轉(zhuǎn)錄的［２７］，而且推測(cè)ｃａｓ基因編碼酶結(jié)構(gòu)域［２４，２６，２８，２９］，所以綜合起來(lái)推測(cè)〇１１３？１＾３８是一個(gè)ＲＮＡｓ是侵染的記憶標(biāo)記２００７年，乳酸桿菌與嗜熱鏈球首次提供了?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ介導(dǎo)適應(yīng)性免疫實(shí)驗(yàn)證據(jù)［３１］，這個(gè)法就是在牛奶工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中培養(yǎng)的細(xì)菌中含有的天然ＣＲＩ抵御噬菌體的感染，這是一個(gè)成功應(yīng)用ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ于生物０８年，有研究報(bào)道在大腸桿菌中，具有導(dǎo)向作用的成熟Ｃ）與Ｃａｓ蛋白形成復(fù)合物干擾病毒的增殖Ｐｌ，同一年，在病道了?ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系統(tǒng)靶向ＤＮＡ的活性［３４］，后來(lái)研究確定重復(fù)序列（ＣＲＩＳＰＲ，Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ?Ｒｅｇｕｌａｒ丨ｙ?Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ?Ｓｈｏｒｔ和ＣＲＩＳＰＲ相關(guān)蛋白是大多數(shù)細(xì)菌及古細(xì)菌中的一種獲得性來(lái)核酸例如來(lái)自噬菌體ＤＮＡ或ＲＮＡ，質(zhì)粒和其它外源ＤＮ的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系統(tǒng)具有共同的特性，如重復(fù)間隔序列，這是Ｃａｓ核酸酶剪切外來(lái)核酸的相關(guān)特性［３５，３６］。??Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ??

圖３?ＣＲＩＳＰＲ的分類(lèi)分型［４０，４１］??４?ＣＲＩＳＰＲ的作用機(jī)制??ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ免疫系統(tǒng)的作用機(jī)制主要包括三步，ＤＮＡ的編碼，ＲＮＡ的導(dǎo)向靶向ＤＮＡ。第一步就是間隔序列的獲取，Ｃａｓｌ和Ｃａｓ２將外源入侵的核酸序列整到ＣＲＩＳＰＲ序列的５’端中也就是鄰近前導(dǎo)序列成為新的間隔序列；第二步是ＣＲＩＳＰ序列表達(dá)產(chǎn)生成熟前體ＣＲＩＳＰＲ?ＲＮＡ?（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ），它是一個(gè)單鏈的ＲＮＡ分子含所有的重復(fù)間隔序列。Ｉ型系統(tǒng)Ｃａｓ６處理加工Ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ?（Ｉ－Ｃ型是由Ｃａｓ５加處理），在ＩＩ型系統(tǒng)中是由ＲＮａｓｅ?ＩＩＩ和Ｃａｓ９加工處理，使ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ成為成熟ｃｒＲＮＡ?（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）；最后一步是干擾與間隔序列互補(bǔ)的入侵核酸。在Ｉ型系中，ｃｒＲＮＡ與Ｃａｓｃａｄｅ復(fù)合物相互作用產(chǎn)生效應(yīng)復(fù)合物依賴(lài)間隔序列與促間隔序之間的互補(bǔ)性識(shí)別和結(jié)合外源入侵的雙鏈ＤＮＡ，并招募Ｃａｓ３來(lái)切割靶向ｄｓＤＮｃｒＲＮＡ與互補(bǔ)耙向ＤＮＡ鏈之間的堿基配對(duì)將導(dǎo)致非耙向ＤＮＡ鏈Ｒ?ｌｏｏｐ的形成然后Ｃａｓ３的核酸外切酶活性在促間隔序列之內(nèi)切割非靶向鏈并以一種依賴(lài)鐵


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