【摘要】：淋巴細胞活化基因-3(Lymphocyte activation gene-3,LAG3)是表達在T細胞表面的抑制性受體(Inhibitory receptor,IR)。T細胞表達多種IRs,如T淋巴細胞相關(guān)抗原4(T-lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)和程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein-1,PD-1)等,來避免由于免疫反應(yīng)的失控導致的免疫細胞過度活化、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的持續(xù)時間和幅度、維持免疫耐受、避免組織損傷和自身免疫病的發(fā)生。但是IRs持續(xù)性的高表達,可抑制T細胞功能,導致T細胞的無應(yīng)答,無法發(fā)揮免疫作用。靶向封閉IRs,使T細胞恢復(fù)活性已被證明可顯著增強抗病毒和抗腫瘤的免疫反應(yīng),這些IRs也因此被稱為免疫檢查點(immune checkpoint)。目前,靶向性封閉CTLA-4、PD-1或其配體PD-L1的治療手段已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療多種腫瘤,這表明了阻斷T細胞抑制性信號用于疾病治療的可行性。但是仍有很多患者未從這些藥物中獲益,因此仍然需要更多靶向各種類型免疫檢查點的研究。LAG3也是一種免疫檢查點,當其與MHCⅡ結(jié)合時可直接抑制T細胞活化的第一信號,負性調(diào)控T細胞的功能。靶向封閉LAG3可通過抑制LAG3傳導的抑制信號,顯著增強T細胞活性,進而提高免疫反應(yīng)。目前,尚未見到靶向LAG3的寡核苷酸類抑制物的報道。在本研究中,設(shè)計了靶向LAG3的反義寡核苷酸,并探究了其維持T細胞反應(yīng)的效應(yīng)以及作為重組蛋白疫苗和滅活流感病毒疫苗佐劑的可能性。在探究靶向LAG3的反義寡核苷酸是否也能作為腫瘤疫苗佐劑增強抗腫瘤活性的研究中,我們意外的觀察到了Lewis肺癌腫瘤裂解物引起的小鼠十二指腸致死性壞死,并探討了此種壞死發(fā)生的可能原因。1.LAG3干擾反義寡核苷酸的設(shè)計與篩選為了設(shè)計靶向LAG3的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASOs),利用NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫分別獲得人和小鼠的LAG3 mRNA序列,并通過BLAST網(wǎng)站篩選出可用于設(shè)計ASOs的保守區(qū)。在對保守區(qū)序列進行特異性檢測后,篩選出15個可用于設(shè)計ASOs的靶向區(qū)域。然后,設(shè)計出15個與這些靶向區(qū)域完全反向互補的ASOs,并利用“sfold”和“mfold”網(wǎng)站以結(jié)合位點的二級結(jié)構(gòu)、結(jié)合自由能以及是否含有惰性序列作為篩選指標對這些序列進行評估。結(jié)果顯示,有兩個符合要求的LAG3干擾寡核苷酸(LAG3 interfering antisense oligonucleotides,LIOs),即LIO-1和LIO-2,可用于后續(xù)研究。2.LIO進入免疫細胞的情況分析為了探究LIO能否進入免疫細胞尤其是T細胞,將LIO-1和LIO-2分別標記了Cy3熒光信號后,采用流式細胞術(shù)觀察了na?ve ICR小鼠淋巴結(jié)細胞和脾細胞中的總T細胞、CD4~+T細胞、CD8~+T細胞、B細胞以及DC細胞對LIO-1及LIO-2的攝取情況。然后,利用免疫熒光技術(shù)進一步觀察了LIO是否能定位于T細胞內(nèi)部。結(jié)果顯示,淋巴結(jié)細胞及脾細胞中的主要免疫細胞均可攝取LIO-1和LIO-2,并且LIO-1和LIO-2可定位于CD4~+T細胞和CD8~+T細胞的內(nèi)部。結(jié)果提示:LIO-1和LIO-2均可以進入T細胞內(nèi)部。3.LIO對T細胞LAG3表達的抑制效應(yīng)為了探究LIO-1和LIO-2是否可以抑制LAG3的表達,首先利用RT-PCR技術(shù)檢測了LIO對脾細胞中LAG3 mRNA表達的影響,然后利用流式細胞術(shù)分別檢測了LIO對脾和引流淋巴結(jié)中的T細胞以及人T細胞淋巴瘤細胞系(Jurkat)細胞LAG3蛋白表達的影響。結(jié)果顯示:1)LIO-1可抑制脾細胞中LAG3 mRNA的表達,LIO-2無明顯作用;2)LIO-1可降低脾和引流淋巴結(jié)中CD4~+T細胞和CD8~+T細胞LAG3的表達,LIO-2無此效果;3)LIO-1可減少Jurkat細胞表面LAG3的表達,LIO-2仍然沒有顯著效果。由此可見,LIO-1可抑制LAG3的表達,但是LIO-2未能發(fā)揮抑制作用。4.在recall反應(yīng)中LIO對抗原特異性T細胞反應(yīng)的影響為了探究在recall反應(yīng)中LIO對抗原特異性T細胞反應(yīng)的影響,分離了LIO聯(lián)合重組豬圓環(huán)病毒2b型(porcine circovirus type 2b,PCV2b)衣殼蛋白(CP)疫苗免疫的小鼠的脾細胞后,在體外使用CP蛋白再次刺激。然后利用T細胞增殖實驗檢測了抗原特異性CD4~+T和CD8~+T細胞的增殖情況。此外,還采用實時定量PCR技術(shù)檢測了上述脾細胞在CP刺激后,細胞因子干擾素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)、白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-4和IL-6的mRNA表達情況。結(jié)果顯示:1)LIO-1可以顯著提高重組蛋白疫苗誘導的抗原特異性CD4~+T細胞的增殖比例,但對抗原特異性CD8~+T細胞的增殖比例無明顯影響;2)LIO-1可顯著提高脾細胞中IFN-γ、IL-2和IL-6的mRNA表達水平。由此可見,在recall反應(yīng)中,當再次暴露于抗原時,LIO-1可以促進重組蛋白疫苗誘導的抗原特異性CD4~+T細胞增殖以及細胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的產(chǎn)生。5.LIO對維持抗原特異性T細胞活化的影響為了進一步探究在體內(nèi)LIO對維持抗原特異性T細胞活化的影響,本研究在小鼠第二次免疫LIO聯(lián)合重組CP蛋白疫苗48h后,利用流式細胞術(shù)檢測了小鼠引流淋巴結(jié)和脾中CD4~+T細胞和CD8~+T細胞表面T細胞早期活化標志CD69的表達情況。此外,本研究還利用實時定量PCR技術(shù)檢測了上述引流淋巴結(jié)細胞和脾細胞中細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6 mRNA的表達水平。結(jié)果顯示:1)LIO-1可提高重組蛋白疫苗誘導的引流淋巴結(jié)細胞中CD4~+CD69~+T細胞的比例。2)LIO-1可提高重組蛋白疫苗誘導的引流淋巴結(jié)細胞中IFN-γ和IL-2的mRNA表達。由此可見,LIO-1在體內(nèi)可維持引流淋巴結(jié)中CD4~+T細胞的活化,并可促進細胞因子IFN-γ和IL-2的產(chǎn)生。6.LIO對重組蛋白疫苗和滅活流感病毒疫苗誘導的抗體反應(yīng)的促進作用由于LIO-1可顯著增強CD4~+T細胞反應(yīng),這提示其有可能可以促進重組蛋白疫苗和滅活流感病毒疫苗誘導的抗體反應(yīng)。為了驗證這一猜想,本研究使用間接ELISA技術(shù)檢測了LIO-1聯(lián)合重組CP蛋白疫苗或是聯(lián)合滅活FM1流感病毒疫苗免疫小鼠時,誘導的抗體反應(yīng)。結(jié)果顯示:1)LIO-1可顯著提高重組CP蛋白疫苗誘導的抗體水平;2)LIO-1可顯著提高滅活FM1流感病毒疫苗誘導的抗體水平。由此可見,LIO-1可作為佐劑,增強重組蛋白疫苗和滅活病毒疫苗誘導的抗體反應(yīng)。7.CD8~+T細胞和IFN-γ與小鼠十二指腸壞死的相關(guān)性觀察在進一步探究LIO-1是否也能作為腫瘤疫苗佐劑時,我們意外的發(fā)現(xiàn)了Lewis肺癌腫瘤裂解物疫苗(LCLV)注射na?ve C57BL/6小鼠可引起廣泛的十二指腸致死性壞死。為了探究這一現(xiàn)象發(fā)生的原因,na?ve小鼠注射LCLV后,在小鼠瀕死時,利用流式細胞術(shù)分別檢測了小鼠外周血白細胞(peripheral white blood cells,PWBC)、脾細胞及引流淋巴結(jié)細胞中CD4~+T細胞和CD8~+T的比例,并利用實時定量PCR技術(shù)檢測了小鼠PWBC和脾細胞中IFN-γmRNA的表達情況。注射生理鹽水的小鼠作為對照。結(jié)果顯示:1)注射LCLV的小鼠PWBC中CD8~+T細胞比例增高了5倍,達到約50%。2)相比于正常小鼠,注射LCLV的小鼠PWBC中IFN-γ表達水平迅速提高了約12倍。這提示,小鼠外周血中顯著的CD8~+T和IFN-γ產(chǎn)生的增高可能與十二指腸致死性壞死存在相關(guān)性。綜上所述,在本研究中,設(shè)計了靶向LAG3的反義寡核苷酸藥物(LIO-1),并證明LIO-1能進入T細胞內(nèi)部;可誘導LAG3 mRNA的降解;抑制CD4~+T細胞LAG3的表達;維持抗原特異性CD4~+T細胞的增殖;促進CD4~+T細胞的活化;促進細胞因子IFN-γ、IL-2和IL-6的產(chǎn)生;增強重組蛋白疫苗和滅活流感病毒疫苗誘導的抗體反應(yīng)。因此,LIO-1作為LAG3的核酸類抑制劑,可以增強微生物疫苗誘導的抗體反應(yīng),有成為一種新型佐劑的潛能。此外,在本研究中還意外發(fā)現(xiàn)了小鼠外周血中顯著升高的CD8~+T細胞和IFN-γ產(chǎn)生可能與十二指腸致死性壞死存在相關(guān)性。這一發(fā)現(xiàn),如果能被進一步證明,可能有助于在臨床上通過檢測外周血CD8~+T細胞和IFN-γ水平來提示患者發(fā)生十二指腸廣泛壞死的風險和通過降低外周血CD8~+T細胞和IFN-γ水平防止十二指腸廣泛壞死的發(fā)生。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R392
【圖文】：

激受體和抑制性受體共同作用調(diào)imulatory and inhibitory interacions of the ligand and receptor betpicted. Some of the ligand and recehile the others deliver inhibitory sigantigen 4; PD1: programmed cell P1: B7-related protein 1; ICOS: inducyte attenuator; KIR: killer cell immivation gene 3; HVEM: herpesvirul membrane protein 3; A2aR: adenotor-β; IL, interleukin.

LAG3結(jié)構(gòu)及sLAG3脫落[26]

聯(lián)系可提高 T 細胞反應(yīng)并增強抗腫瘤免疫效果。FGL1 在表達，并且 FGL-1 與 LAG3 的結(jié)合與腫瘤患者 PD-1 靶向]。觸核蛋白經(jīng)系統(tǒng)中的 -突觸核蛋白也可與 LAG3 結(jié)合[49]。LAG3的預(yù)成型原纖維（preformed fibrils, PFFs）強有力的結(jié)合過 PFFs 在神經(jīng)元間的病理性傳遞。這一過程與帕金森病森病發(fā)病機理中錯誤折疊的 -突觸核蛋白在細胞間“阮病[50-52]。
【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 余莉;孕前接種CMV糖蛋白疫苗對先天性CMV感染豚鼠模型的保護作用[J];國外醫(yī)學.預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;2001年05期

2 方海紅;imiquimod單獨或與糖蛋白疫苗聯(lián)合使用減少復(fù)發(fā)性HSV病[J];國外醫(yī)學.預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;2001年05期

3 任繼玲;王華;楊明;王麗;吳秀麗;王麗穎;于永利;;人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗的計算機輔助設(shè)計及真核表達[J];細胞與分子免疫學雜志;2010年01期

4 廖芳;賀超;劉麗江;宋啟發(fā);萬沐芬;楊振德;李雍龍;;淋球菌孔蛋白疫苗在動物體內(nèi)誘導的免疫應(yīng)答[J];中國婦幼保健;2005年24期

5 徐萬祥;蛋白疫苗緩釋體系研究概況[J];生殖醫(yī)學雜志;1996年02期

6 李文桂;陳雅棠;;豬帶絳蟲45W蛋白疫苗的研制現(xiàn)狀[J];中國病原生物學雜志;2012年03期

7 吳婷;歐山海;程通;何水珍;伍小路;鄭舟;張軍;夏寧邵;;戊型肝炎病毒重組顆粒性蛋白疫苗在小鼠體內(nèi)誘導的免疫應(yīng)答研究[J];病毒學報;2005年06期

8 郝建軍;;亞單位糖蛋白疫苗免疫動物后原發(fā)無癥狀單純皰疹病毒感染的檢測[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);1990年06期

9 程魯向;重組2型單純皰疹病毒(HSV-2)糖蛋白疫苗的安全性和效力[J];國外醫(yī)學.預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1996年03期

10 馬中瑞;韓東雷;趙駿菲;陳夢琳;陳敏;;利用大腸桿菌生產(chǎn)N-糖蛋白和糖蛋白疫苗的研究進展[J];中國生物工程雜志;2013年11期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李志琴;LAG3干擾寡核苷酸作為重組蛋白疫苗和滅活流感病毒疫苗佐劑的研究[D];吉林大學;2019年

2 李艷利;宮頸癌HPV蛋白疫苗和腫瘤SP細胞的研究[D];南京大學;2008年

3 王秀麗;hCGβ-C3d3融合蛋白疫苗的體液免疫效應(yīng)及其抗生育潛能[D];復(fù)旦大學;2004年

4 譚光宏;重組異種endoglin蛋白疫苗抗腫瘤作用研究[D];四川大學;2004年

5 曾瑞紅;RSV重組蛋白疫苗的制備及其免疫原性和保護性研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2006年

6 章宏海;熱激蛋白HSP70融合蛋白疫苗的抗腫瘤作用研究以及HSP70在免疫調(diào)控中的作用[D];復(fù)旦大學;2006年

7 李金耀;通過共免疫鼠卵透明帶3 DNA和蛋白疫苗技術(shù)增強免疫不孕效果及降低卵巢炎癥反應(yīng)的研究[D];新疆大學;2007年

8 滕新棟;結(jié)核病亞單位蛋白疫苗的免疫原性和保護性[D];華中科技大學;2015年

9 劉波;雙功能HPV治療性融合蛋白疫苗的抗癌作用實驗研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2008年

10 宋欣欣;提高HPV融合蛋白疫苗療效策略研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2010年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 袁偉;含結(jié)核分枝桿菌多階段抗原融合蛋白疫苗的構(gòu)建及免疫原性分析[D];安徽理工大學;2019年

2 劉康;弓形蟲MIF蛋白疫苗對BALB/c小鼠免疫保護作用的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2019年

3 趙莉群;重組金黃色葡萄球菌腸毒素B蛋白疫苗的制備及免疫效果評價[D];西北農(nóng)林科技大學;2011年

4 任繼玲;口蹄疫重組蛋白疫苗的計算機輔助設(shè)計及功能研究[D];吉林大學;2007年

5 崔珂;CpG ODN對口蹄疫重組蛋白疫苗增效作用的研究[D];吉林大學;2010年

6 李菲;結(jié)核潛伏抗原篩選與治療性融合蛋白疫苗的制備[D];蘭州大學;2016年

7 趙明麗;DNA疫苗預(yù)敏蛋白疫苗增強策略對乙型肝炎病毒表面抗原蛋白免疫應(yīng)答的影響[D];南京醫(yī)科大學;2009年

8 白瑞珍;豬endoglin胞外段DNA疫苗與蛋白疫苗聯(lián)合治療腫瘤機理的研究[D];山西醫(yī)科大學;2006年

9 徐曼;肺炎鏈球菌StkP蛋白疫苗研究[D];吉林大學;2014年

10 肖春羽;黃芪多糖在白色念珠菌重組蛋白疫苗中免疫增強作用研究[D];東北師范大學;2013年

本文編號：2892086