目的隨著蛋白質(zhì)組學與多肽組學的發(fā)展,快速獲取小分子多肽的濃度對研究多肽的性能及作用機制十分重要。目前實驗室測定小分子多肽濃度的方法在難易度、適用范圍、經(jīng)濟性等方面各有千秋,因此,有待我們提出一種快速簡便的多肽濃度測定方法。方法將牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)與固相合成環(huán)肽CYE(NH_2-CYENLRSTC-COOH,C_1-C_9二硫鍵成環(huán))、CLP(NH_2-CLPLWYPSC-COOH,C_1-C_9二硫鍵成環(huán))及CHY(NH_2-CHYPTYSKC-COOH,C_1-C_9二硫鍵成環(huán))溶液梯度稀釋后分別使用消光系數(shù)法和BCA法進行吸光度測定,通過消光系數(shù)公式或標準曲線方程式計算相應濃度值,比較濃度計算值與理論值之間的差異并計算測定方法的精密度。將對羥磷灰石粉末可能有不同親和力的多肽CYE與1018(VRLIVAVRIWRR)溶液進行梯度稀釋,以非特異性吸附的BSA為對照,分別與25mg/mL羥磷灰石懸浮液在37℃下共同孵育1小時,離心后取上清液并應用個性化標準曲線的BCA法進行濃度測定,根據(jù)濃度計算結果評價BSA、CYE與1018在羥磷灰石粉末表面的吸附量。結果消光系數(shù)法的濃度計算值與理論值之間無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。BCA法中,以BSA作為標準品得到的多肽濃度計算值與理論值之間有顯著統(tǒng)計學差異(P0.05);以待測多肽自身為標準品求得的多肽濃度計算值與理論值之間無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05);與待測多肽長度相同、分子量相近的多肽繪制個性化標準曲線求得的多肽濃度計算值與理論值之間存在統(tǒng)計學差異(P0.05),但求得的濃度計算值相比BSA標準曲線的濃度計算值更接近理論值(P0.05)。不同方法的精密度之間無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。應用多肽自身繪制個性化標準曲線的BCA法評價BSA、CYE與1018在羥磷灰石粉末表面的吸附量,結果表明,在濃度達到75μg/mL時,CYE與1018的吸附量到達平臺期,而BSA有增加趨勢。結論當多肽含有色氨酸或酪氨酸時可以使用消光系數(shù)法;當標準品在結構、疏水性等方面的性質(zhì)越接近待測物,使用個性化標準曲線的BCA法得到的濃度計算值越準確,可用作多肽濃度的快速半定量測定。應用個性化標準曲線的BCA法能夠評價多肽在羥磷灰石表面的吸附量。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R341
【部分圖文】：

圖 1 消光系數(shù)法濃度計算值與濃度理論值比較.2.2 BCA 法與個性化標準曲線的 BCA 法根據(jù) BCA 法（標準品：BSA）與個性化標準曲線的 BCA 法（標準品：CYE、CLHY）的 4 條標準曲線得到的 4 個標準方程式，分別計算出 BSA 與多肽濃度（圖 4）。標準曲線 R2均大于 0.99，線性關系良好。4 條標準曲線的斜率由大到小依 CHY＞CLP＞CYE＞BSA（P＜0.05），與肉眼所見形成的紫色絡合物顏色深淺致。將各組濃度計算值與理論值相比較，如圖 3 所示，在 BCA 法中，使用 BSA 標線計算得到的 CYE、CLP 與 CHY 的濃度計算值大于理論值，而使用 CYE、C CHY 的個性化標準曲線分別計算 BSA 的濃度值，其計算結果均小于理論值（P.05）；使用 CYE 標準曲線計算 CLP 與 CHY 的濃度，二者計算值均大于理論值（0.05）；使用 CLP 標準曲線計算 CYE 與 CHY 的濃度，CYE 濃度計算值小于理

華 中 科 技 大 學 碩 士 學 位 論 文 與 CLP 濃度，二者計算值均小于理論值（P＜0.05）。述結果可知，不管是 BCA 法還是個性化標準曲線的 BCA 法，使用 BSA是 CYE、CLP 與 CHY 個性化標準曲線得到的濃度計算值與理論值之間均異。比較不同標準曲線下的濃度計算值與理論值之間的差值的統(tǒng)計學差異果表明，個性化標準曲線的 BCA 法的濃度計算值比 BCA 法的濃度計算值值（P＜0.05）。

圖 3 不同標準曲線計算同一蛋白或多肽的濃度計算值與理論值的比較2.2.3 BSA、CYE、CLP 與 CHY 標準曲線計算自身濃度分別用 BSA、CYE、CLP 與 CHY 標準曲線計算自身濃度，其標準方程及 R2如表5 所示。計算結果表明 BSA、CYE、CLP 以及 CHY 通過自身標定計算的濃度計算值均與理論值無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖 4）。R2均大于 0.99，線性良好。表 5 自身個性化標準曲線的 BCA 法標準曲線公式及 R 平方值Satandard Satandard curve R2BSA y = 0.0003x + 0.1216 0.9961CYE y = 0.0005x + 0.1205 0.9987CLP y = 0.0010x + 0.1105 0.9993CHY y = 0.0013x + 0.1292 0.9978
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本文編號：2887721