本文關鍵詞：胞紅蛋白對巨噬細胞氧化損傷的保護作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]胞紅蛋白(cytoglobin,CYGB)是一種新發(fā)現(xiàn)的攜氧球蛋白,CYGB在神經(jīng)細胞缺氧時表達明顯增加并具有明顯的細胞保護作用。本文探討巨噬細胞氧化應激過程中CYGB表達模式;構(gòu)建CYGB過表達/低表達巨噬細胞模型,研究CYGB在氧化應激過程中對巨噬細胞的作用。[方法]1、將小鼠巨噬細胞株RAW264.7、人巨噬細胞株THP-1、EC及人肝癌細胞Hep G2擴增后,Western blot檢測正常生理狀態(tài)下RAW264.7、THP-1、EC及Hep G2細胞中CYGB蛋白的表達水平。2、將小鼠巨噬細胞株RAW264.7擴增后,Western blot檢測RAW264.7在H2O2刺激不同時間時CYGB的蛋白表達水平:分為4組:對照組,0.5mmol/L H2O2處理6、12、24 h組。Western blot檢測RAW264.7在不同濃度H2O2刺激12h時CYGB蛋白的表達水平:分為4組:對照組,0.25mmol/L H2O2、0.5mmol/L H2O2、1mmol/L H2O2處理組。3、首先構(gòu)建CYGB過表達/低表達巨噬細胞模型。然后觀察在氧化應激過程中CYGB對RAW264.7小鼠巨噬細胞的作用,將RAW264.7細胞分為4組:對照組、0.5mmol/L H2O2處理組、0.5mmol/L H2O2+CYGB過表達組及0.5mmol/L H2O2+CYGB低表達組。于12h后,檢測CYGB蛋白水平、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、乳酸脫氫(LDH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD);熒光定量PCR檢測CYGB、NF-κB在細胞中的表達。[結(jié)果]1、Western blot結(jié)果顯示:在正常生理狀態(tài)下,CYGB在小鼠巨噬細胞株RAW264.7、人巨噬細胞株THP-1、人臍靜脈內(nèi)皮細胞EC及人肝癌細胞Hep G2中均有表達。2、Western blot結(jié)果顯示:H2O2處理6、12、24 h組CYGB表達水平高于對照組,并且在12h組CYGB表達水平最高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。0.25mmol/L H2O2、0.5mmol/L H2O2和1mmol/L H2O2處理巨噬細胞12h后CYGB表達水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3、熒光顯微鏡結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染CYGB過表達質(zhì)粒及CYGB低表達質(zhì)粒的巨噬細胞在熒光顯微鏡下可見綠色熒光。4、Western blot結(jié)果顯示:0.5mmol/L H2O2處理組、0.5mmol/L H2O2+CYGB過表達組及0.5mmol/L H2O2+CYGB低表達組CYGB蛋白表達水平均高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。0.5mmol/L H2O2+CYGB過表達組的CYGB表達最高(P0.05),0.5mmol/L H2O2+CYGB低表達組的CYGB表達較0.5mmol/L H2O2處理組低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)和ROS檢測結(jié)果顯示:與0.5mmol/L H2O2相比,0.5mmol/L H2O2+CYGB過表達組中GSH-PX、SOD升高,LDH、MDA、ROS下降;與0.5mmol/L H2O2組相比,0.5mmol/L H2O2+CYGB低表達組中GSH-PX、SOD下降,LDH、MDA、ROS升高。熒光定量PCR檢測顯示:與正常對照組比較,H2O2處理組CYGB和NF-κB表達均上調(diào)(P0.05)。與H2O2對照組比較,CYGB過表達組CYGB表達較高,NF-κB表達較低(P0.05);CYGB低表達組CYGB表達較低,NF-κB表達較高(P0.05)。[結(jié)論]1.CYGB在巨噬細胞中表達,在H2O2刺激時表達水平增加。2.CYGB在巨噬細胞氧化應激損傷過程中具有細胞保護作用。
【關鍵詞】：巨噬細胞 氧化應激 胞紅蛋白 H2O2
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392.12
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 緒論14-20
• 1.1 前言14-18
• 1.2 技術路線18-20
• 第2章 實驗材料20-22
• 2.1 細胞株20
• 2.2 主要試劑20
• 2.3 主要儀器20-21
• 2.4 數(shù)據(jù)處理和分析21-22
• 第3章 實驗方法22-40
• 3.1 細胞培養(yǎng)22-23
• 3.1.1 細胞復蘇22
• 3.1.2 細胞傳代22-23
• 3.1.3 細胞凍存23
• 3.2 實驗分組23-24
• 3.3 CYGB在各種細胞中的表達24-26
• 3.3.1 試劑配制24-25
• 3.3.2 蛋白提取25
• 3.3.3 蛋白定量25
• 3.3.4 SDS-PAGE電泳25-26
• 3.4 H_2O_2處理巨噬細對CYGB表達的影響26-27
• 3.4.1 H_2O_2處理RAW264.7 不同時間對CYGB表達的影響26-27
• 3.4.2 不同濃度H_2O_2處理RAW264.7 對CYGB表達的影響27
• 3.5 CYGB過表達和低表達巨噬細胞模型的構(gòu)建和鑒定27-31
• 3.5.1 溶液的配制27-28
• 3.5.2 培養(yǎng)受體菌28
• 3.5.3 制備感受態(tài)細胞28
• 3.5.4 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化28
• 3.5.5 質(zhì)粒的提取28-30
• 3.5.6 細胞轉(zhuǎn)染30-31
• 3.6 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力的測定31-32
• 3.6.1 試劑組成及配制31
• 3.6.2 樣本的前處理31
• 3.6.3 細胞中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力測定操作表31-32
• 3.7 超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測32-33
• 3.7.1 試劑組成與配制32-33
• 3.7.2 樣本的前處理33
• 3.7.3 細胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測操作表33
• 3.8 乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測33-34
• 3.8.1 試劑組成及配制33-34
• 3.8.2 樣本的前處理34
• 3.8.3 培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)檢測操作表34
• 3.9 丙二醛(MDA)活性檢測34-35
• 3.9.1 試劑的組成與配制34-35
• 3.9.2 樣品前處理35
• 3.9.3 細胞中丙二醛(MDA)活性檢測操作表35
• 3.10 活性氧(ROS)活性檢測35-36
• 3.10.1 試劑組成及保存35-36
• 3.10.2 操作步驟36
• 3.11 熒光定量PCR檢測CYGB、NF-κB在細胞中的表達36-40
• 3.11.1 溶液配制36
• 3.11.2 RNA提取36-37
• 3.11.3 RNA反轉(zhuǎn)錄37-38
• 3.11.4 熒光定量-PCR38-40
• 第4章 實驗結(jié)果40-52
• 4.1 細胞形態(tài)學觀察結(jié)果40-41
• 4.2 CYGB在各種細胞中的表達41
• 4.3 H_2O_2處理RAW264.7 對CYGB表達的影響41-43
• 4.3.1 H_2O_2處理RAW264.7 不同時間對CYGB表達的影響41-42
• 4.3.2 不同濃度H_2O_2處理RAW264.7 對CYGB表達的影響42-43
• 4.4 CYGB過表達和低表達巨噬細胞模型的構(gòu)建和鑒定43-45
• 4.5 CYGB對H_2O_2處理的巨噬細胞的保護作用45-51
• 4.5.1 H_2O_2處理對RAW264.7 細胞CYGB表達的影響45-46
• 4.5.2 CYGB對RAW264.7 細胞GSH-PX活性影響46-47
• 4.5.3 CYGB對RAW264.7 細胞SOD活性影響47-48
• 4.5.4 CYGB對RAW264.7 細胞LDH活性影響48-49
• 4.5.5 CYGB對RAW264.7 細胞MDA活性影響49-50
• 4.5.6 CYGB對RAW264.7 細胞ROS活性影響50-51
• 4.6 熒光定量PCR檢測NF-κB在細胞中的表達51-52
• 第5章 討論52-56
• 第6章 結(jié)論56-58
• 參考文獻58-62
• 文獻綜述62-72
• 參考文獻68-72
• 作者攻讀學位期間的科研成果72-74
• 致謝74-75
• 本研究基金資助項目75

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 張國陽;李道江;揭志剛;李正榮;;胃癌相關DNA甲基化的研究進展[J];廣東醫(yī)學;2014年19期

2 徐中菊;張悅;舒適;李志杰;張瑞義;;胞紅蛋白研究進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2015年10期

3 紀莎;瑪依努爾·尼牙孜;;DNA甲基化與宮頸癌研究進展[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2014年03期

4 李新敏;古雅麗;王香芝;郭華鋒;宮宏宇;;p16、DAPK和ESRβ基因啟動子甲基化與宮頸癌的關系[J];診斷病理學雜志;2015年02期

  本文關鍵詞：胞紅蛋白對巨噬細胞氧化損傷的保護作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：288606