目的:獲得一種新型靶向人Frizzled7(Fzd7)蛋白的人源化抗體。方法:首先用重組人Fzd7蛋白(rh Fzd7)免疫BALB/c小鼠,獲得鼠源抗Fzd7抗體(SHH002),并用生物膜層干涉技術(shù)(biolayer interferometry,BLI)檢測SHH002的親和力;測序獲得SHH002可變區(qū)序列(V區(qū)),通過與Human Germline序列庫比對選擇人源化設(shè)計模板,利用Discoverystudio軟件對SHH002進行人源化設(shè)計,獲得人源化抗Fzd7抗體SHH002-hu,并對SHH002-hu的純度和親和力進行驗證,最后通過MTT實驗初步驗證其抗腫瘤活性。結(jié)果:雜交瘤篩選技術(shù)獲得高親和力(親和力常數(shù)KD 1. 0×10-12mol·L-1)鼠源抗Fzd7抗體SHH002; SHH002 V區(qū)序列比對Human Germline序列庫,選擇同源性最高的IGHV1/IGKV1作為人源化設(shè)計模板,保留對抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用的鼠源氨基酸,將非關(guān)鍵的位點突變?yōu)槿嗽窗被?獲得人源化程度高達(dá)98%的人源化抗體SHH002-hu;分子排阻色譜(SEC-HPLC)檢測其純度 95%,BLI法驗證其KD 1. 0×10-12mol·L-1,MTT實驗表明SHH002-hu可有效抑制三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)細(xì)胞的體外增殖。結(jié)論:本實驗獲得了高度人源化且高親和力的靶向Fzd7抗體SHH002-hu,為多種惡性腫瘤提供一種全新的靶向治療候選方案。
【部分圖文】：

有限稀釋法經(jīng)3～4次克隆化操作，直至所有克隆化細(xì)胞孔檢測陽性率達(dá)100%時，即可確定獲得分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株，挑選效價最高的4株單克隆(1#,2#,3#和11#)擴大培養(yǎng)，并腹腔注射小鼠，7～10 d采集腹水。Western Blot檢測4株腹水與抗原的結(jié)合，圖1顯示4株腹水均檢測到目標(biāo)條帶，其中腹水1#,2#,3#效果較好。箭頭所指條帶為目的條帶所在位置，下部條帶疑為蛋白降解結(jié)合條帶(蛋白立春紅染色后在該位置有明顯條帶)。1.2 SDS-PAGE電泳初步鑒定抗體

SDS-PAGE電泳初步鑒定純化后抗體，如圖2所示。非還原條件下在150 kDa處出現(xiàn)目的條帶，主帶明顯;還原條件下在50和25 k Da處分別出現(xiàn)目的條帶(重鏈和輕鏈)，說明1#,2#,3#抗體重輕鏈表達(dá)正確且裝配完全。1.3鼠源抗Fzd7抗體的免疫球蛋白亞型鑒定

間接ELISA測得的抗體親和力分別為:1#抗體:(4.06±0.24)×10-11mol·L-1(n=3);2#抗體:(9.74±0.64)×10-11mol·L-1(n=3);3#抗體:(7.59±0.58)×10-11mol·L-1(n=3)。ELISA法測得的反應(yīng)曲線如圖3A～C所示。挑選親和力最高的1#抗體(即SHH002)，用BLI法進一步驗證其親和力，實驗結(jié)果顯示SHH002與rhFzd7的結(jié)合常數(shù)(ka)=(2.85±0.17)×104mol-1·L·s-1，解離常數(shù)(kd)<1×10-7s-1,KD<1×10-12mol·L-1(n=3)，結(jié)合解離動力學(xué)過程擬合曲線圖如圖3D所示。對比間接ELISA法，BLI法測得的SHH002親和力更高;分析其原因可能為BLI法中是將抗體偶聯(lián)在芯片上去捕捉流動相中的抗原，相比間接ELISA法中將抗原包被在酶標(biāo)板上去捕捉抗體，更有效地規(guī)避了抗體抗原結(jié)合的空間位阻。以上結(jié)果說明我們已經(jīng)成功獲得穩(wěn)定表達(dá)抗Fzd7抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并得到具有高親和力的鼠源抗Fzd7抗體SHH002。
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2 程聯(lián)勝,邢毅,劉兢;基于公共信息資源的p185抗體人源化設(shè)計[J];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)學(xué)報;2002年05期

3 葛良鵬;丁寧;蘭國成;鄒賢剛;劉作華;;治療性抗體的研究現(xiàn)狀與未來[J];中國生物工程雜志;2013年09期

4 王亭亭;;中科院微生物所研發(fā)獲得寨卡病毒人源治療性抗體[J];首都食品與醫(yī)藥;2017年03期

5 梁琍;;治療性抗體的研究進展[J];生物技術(shù)通訊;2006年05期

6 黃家強;新一代治療用抗體——改型抗體[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);1997年02期

7 張文;劉紅軍;胡志軍;高琰;高志濤;王輝;;兔抗凋亡蛋白酶活化因子-1多克隆抗體的制備、純化與鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2009年01期

8 邢爽;;抗感染抗體[J];國外醫(yī)學(xué)(藥學(xué)分冊);2007年03期

9 吳文冰;蘭小鵬;;抗SSA/Ro抗體研究的新進展[J];江西醫(yī)學(xué)檢驗;2006年03期

10 吳慶軍,唐福林,甘曉丹,史艷萍,鄧學(xué)新,宋琴芳;Ku抗體的檢測及其臨床意義[J];中華內(nèi)科雜志;2000年08期

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1 張頂;DEC-205靶向抗體的制備及其人源化改造[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

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3 陳長春;抗BONTS抗體的制備、篩選及抗體間協(xié)同保護機制的研究[D];上海交通大學(xué);2012年

4 王輝麗;抗體修飾腫瘤細(xì)胞疫苗實驗研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

5 楊躍梅;靶向HER2抗體穩(wěn)定性改造及功能優(yōu)化研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

6 楊彬;工程化的人抗人IgE抗體的制備[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

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1 楊濱;HAb18G/CD147及其單抗的分子模建對接和抗體人源化設(shè)計的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

2 張?zhí)斐?抗蓖麻毒素對可變區(qū)抗體的構(gòu)建和機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2012年

3 劉學(xué)博;山東省不同地區(qū)不同人群三種流感病毒血凝素抗體水平調(diào)查[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 葉偉亮;新型抗EGFR抗體的設(shè)計及功能研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

5 王星懿;采用六西格瑪管理方法研究動物細(xì)胞生產(chǎn)抗體過程產(chǎn)量的穩(wěn)定性[D];華東理工大學(xué);2015年

6 孫夢梅;抗EGFR人源化抗體的構(gòu)建、表達(dá)、純化和功能分析[D];安徽大學(xué);2011年

7 燕格格;Punctin-2多克隆抗體的制備與鑒定[D];湖南大學(xué);2019年

8 吳東明;14-3-3zeta蛋白多克隆抗體的制備與鑒定[D];安徽大學(xué);2007年

9 孫琪琛;納米抗體用于親和純化傳統(tǒng)抗體的研究[D];東南大學(xué);2016年

10 陳曉明;抗人巨細(xì)胞病毒gBn1抗體的制備及鑒定[D];浙江大學(xué);2008年

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