人諾如病毒(Humannoroviruses,,huNoVs)可以引起全世界五分之一的急性胃腸炎,感染所有人群,臨床上以嘔吐、腹瀉、惡心、低燒為主要特征。諾如病毒(Noroviruses,,NoVs)具有遺傳多樣性,分為七個(gè)基因群。GⅠ和GⅡ基因群主要感染人類(lèi),根據(jù)衣殼區(qū)的命名原則至少包含35個(gè)基因型,其中,GⅡ基因群引起的流行最多,己經(jīng)明確有26個(gè)基因型。huNoVs可以識(shí)別組織血型抗原(histo-blood group antigens,HBGAs)作為吸附因子或受體,影響宿主易感性。大量的研究己經(jīng)明確糖受體的結(jié)合特征對(duì)NoVs的流行至關(guān)重要,新流行株出現(xiàn),尤其是罕見(jiàn)毒株發(fā)展成為主要流行株往往會(huì)發(fā)生糖結(jié)合特性的改變。因此,全面了解罕見(jiàn)毒株、暴發(fā)流行株以及進(jìn)化出的新基因型的糖結(jié)合特性,并闡明潛在糖結(jié)合特性變化的分子基礎(chǔ)對(duì)No Vs的預(yù)防控制具有重要意義。本研究主要分為以下三個(gè)部分:在GⅡ基因群中,GⅡ.13/21形成特異性遺傳分支,使用一個(gè)全新的、非傳統(tǒng)的糖受體結(jié)合位點(diǎn)(glycan binding site,GBS)與HBGAs 中的Lewis a(Lea)抗原結(jié)合。在糖結(jié)合特征中,GⅡ.13/21不同于傳統(tǒng)GⅡ基因型而具有新GBS的優(yōu)勢(shì)是什么。本研究通過(guò)表型和結(jié)構(gòu)分析提出有力的證據(jù),GⅡ.13/21這種新的GBS通過(guò)共同的末端結(jié)構(gòu)為β-半乳糖(β-galactose,β3-Gal)的形式識(shí)別一類(lèi)寡糖。本研究發(fā)現(xiàn)在不同時(shí)期散發(fā)的六種GⅡ.13/21 huNoVs的P蛋白均結(jié)合三種末端結(jié)構(gòu)均為β-Gal的寡糖,包括Ⅰ型前體(Lec),乳糖(lactose,Lac)以及mucin core 2;解析了 GⅡ.13 P二聚體與Lec和mucin core 2的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),揭示β3-Gal是主要的糖結(jié)合位點(diǎn),這些說(shuō)明GⅡ.13/21的GBS有著廣泛的結(jié)合譜,這是其靶向人群的優(yōu)勢(shì)。于此同時(shí),發(fā)現(xiàn)脫脂奶粉和乳糖可以有效地抑制GⅡ.13/21 P蛋白與寡糖唾液的結(jié)合,說(shuō)明脫脂奶粉和乳糖可以充當(dāng)誘餌受體而抑制病毒的感染,可能導(dǎo)致GⅡ.13/21病毒的低流行。2016-2017年冬季一株罕見(jiàn)的重組毒株GⅡ.P16-GⅡ.2在多個(gè)國(guó)家暴發(fā)流行,同期出現(xiàn)的有GⅡ.P16-GⅡ.1。在以往的報(bào)道中,GⅡ.2和GⅡ.1不與HBGAs結(jié)合,結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)GⅡ.2衣殼蛋白的Asp382和GⅡ.1衣殼蛋白的Asp375與HBGAs結(jié)合的方向發(fā)生反轉(zhuǎn)。那么,由罕見(jiàn)毒株發(fā)展成為暴發(fā)流行株,GⅡ.2和GⅡ.1的糖受體結(jié)合情況是否發(fā)生改變。本研究中通過(guò)一系列功能實(shí)驗(yàn)、結(jié)構(gòu)解析明確了 2016年暴發(fā)流行株GⅡ.2以及同一時(shí)間出現(xiàn)的GⅡ.1衣殼蛋白的糖結(jié)合特征。通過(guò)結(jié)構(gòu)解析表明GⅡ.2和GⅡ.1的衣殼蛋白HBGAs結(jié)合位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)Asp382和Asp375發(fā)生改變,朝向與HBGAs結(jié)合的方向。NoVs為RNA病毒,進(jìn)化速率較快。GⅡ.23/24/25是最近報(bào)道的NoVs新基因型,糖受體結(jié)合特征及其相互作用分子基礎(chǔ)仍不明確。本研究通過(guò)唾液和寡糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)明確了GⅡ.23/24/25 P蛋白與HBGAs的結(jié)合特征,發(fā)現(xiàn)其與A/B型唾液和H雙糖前體抗原結(jié)合;GⅡ.25與H雙糖抗原的復(fù)合物晶體結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)特征與傳統(tǒng)GⅡ相似,H雙糖與P蛋白的結(jié)合位點(diǎn)位于P 二 聚體的交界面,巖藻糖作為主要結(jié)合位點(diǎn)。這一結(jié)果表明諾如病毒GⅡ基因群在自然選擇壓力下,新基因型的進(jìn)化特征趨向于傳統(tǒng)的GⅡ基因型的HBGAs結(jié)合特征。綜上所述,本研究利用功能實(shí)驗(yàn)和結(jié)構(gòu)解析擴(kuò)大了 GⅡ基因群中GⅡ.13/21的結(jié)合譜,明確了其與糖抗原結(jié)合的獨(dú)特機(jī)制以及流行相關(guān)性,鑒定了流行重組毒株GⅡ.P16-GⅡ.2、GII.P16-GII.1以及新基因型GII.23/24/25的糖受體結(jié)合特征。這些為huNoVs暴發(fā)流行機(jī)制,宿主病毒相互作用,疫苗及抗病毒藥物研發(fā)提供參考。
【學(xué)位單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R373.2
【部分圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ?１?Ｔｈｅ?ｈｕｍａｎ?ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ?ｇｅｎｏｍｅ??１．２諾如病毒的遺傳多樣性??根據(jù)完整ＶＰ１蛋白序列的多樣性，ＮｏＶｓ分為七個(gè)基因群（ＧＩ－ＧＶＩＩ）（圖２）??［】３’１４］。除了?ＧＩＩ基因群中ＧＩＩ．ｉｌ／１８／１９這一分支感染豬、ＧＩＶ．２感染犬類(lèi)外，ＧＩ、??ＧＩＩ、ＧＩＶ基因群主要引起人的感染，其中，ＧＩ和ＧＩＩ基因型是引起ｈｕＮｏＶｓ的??主要基因型，ＧＩＶ基因型在流行以及散發(fā)案例中檢出減少。ＧＩＩＩ基因簇主要感染??牛羊動(dòng)物，ＧＶＩ．１感染鼠類(lèi)，ＧＶ．２感染兔，ＧＩＶ．２感染貓和犬類(lèi)［１５］，ＧＶＩ和ＧＶＩＩ??感染犬類(lèi)。最近報(bào)道中，根據(jù)聚合酶去和衣殼區(qū)序列的雙命名原則，ＧＩＩ基因簇??的衣殼區(qū)出現(xiàn)了?ＧＩＩ．２３／２４／２５／２６四株新的基因型，以及三株初步認(rèn)定的基因型，??ＧＩＩ．ＮＡ１－ＧＩＬＮＡ３［ｉ６１８］。??１．３諾如病毒的病原學(xué)及流行病學(xué)特征??ＮｏＶｓ成為一種常見(jiàn)的病原體是由許多因素導(dǎo)致，比如，感染劑量較低，少??于２０個(gè)病毒顆粒即可使人群感染Ｎ〇Ｖｓ［１９］；患病期間

分別在?ａ－１．２?巖藻糖轉(zhuǎn)移酶（ａ－ｌ，２ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＦＵＴ２）、ａ－１，３／４?巖藻??糖轉(zhuǎn)移酶（ａ－ｌ，３／４ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，?ＦＵＴ３）、Ａ／Ｂ?糖基轉(zhuǎn)移酶（ＡｏｒＢｅｎｚｙｍｅｓ）??下催化而成（圖３）。山于多個(gè)二糖前體以及ＨＢＧＡｓ的三個(gè)家族含有沉默等位基??因可能導(dǎo)致基因座上的顯性基因無(wú)效，所以人群中ＨＢＧＡｓ表型具有多態(tài)性。例??６??

將過(guò)夜培養(yǎng)的菌體以丨：１００的比例加入大的三角瓶中，按照小表達(dá)方法的??留取超聲破碎后的上清液進(jìn)行蛋白純化。所有重組蛋白都要經(jīng)過(guò)ＧＳＴ親和層析??純化和酶切，經(jīng)過(guò)ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳后，在約３６ＫＤａ處可見(jiàn)目的蛋白（圖１．１），??Ｐ顆粒測(cè)定濃度后即可用于功能實(shí)驗(yàn)。??／?“?／?／?／?／＃?，?／?／?／??／／／／／／?／＃／／／＃?／?／／??８０?Ｓ?８０??ＣＯ．?．???，??５８?必？如？一?ｍｍｍ?＊？＞？＊＊?－?ａ??＾?，?４６??。?働雜■？麵騰義一＊擊一—痛一??２５?｜ａＫｅ？?２￥懂：??２２：｜＾－?２２＿??圖１．１?Ｐ顆粒蛋白純化??Ｍ：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｐ?Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ?Ｐｒｏｔｅｉｎｓ??Ｍ：?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｍａｓｓ?ｍａｒｋｅｒ??ＳＣＩ?０６５、ＳＣＩ０６５／２９７、０８Ｎ２０４５?Ｐ?ｄｉｍｅｒ蛋白在ＧＳＴ親和層析之后，再由凝??膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化，使用ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００】０／６００ＧＬ柱進(jìn)行純化，ＵＶ２８０曲線在??４２??
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