目的:本實驗通過采用前交叉韌帶橫斷加內(nèi)側半月板切除的方法構建SD大鼠骨關節(jié)炎(OA)模型,觀察其大體變化,向OA大鼠模型的關節(jié)腔內(nèi)注射慢病毒介導的微小RNA(miRNA)-411,使軟骨組織中表現(xiàn)出miR-411過表達及低表達狀態(tài),并檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13、Ⅱ型膠原和Ⅳ型膠原的表達,從而研究miR-411及MMP-13對大鼠OA模型中軟骨損傷的作用,對miR-411在OA發(fā)生發(fā)展中的作用機制進行了初步的研究。方法:構建SD大鼠OA模型,取8-10周齡,體重為280-300g雄性SD大鼠40只,隨機分為4組:A組為手術組;B組為手術聯(lián)合注射miR-411 mimics;C組為手術聯(lián)合注射miR-411 inhibitor;D組為假手術聯(lián)合注射miR-411 LV陰性對照組(每組10只)。手術組行右膝前交叉韌帶橫斷加內(nèi)側半月板切除。對照組僅打開關節(jié)囊,不破壞前交叉韌帶和內(nèi)側半月板,在OA模型手術后的第7天和第14天將100uL慢病毒介導的miR-411 mimics(3*10~8 TU/ml),miR-411 inhibitor(2?3*~8 TU/ml),miR-411 LV陰性對照(5*10~8 TU/ml)分別注射到相應分組的SD大鼠OA模型的膝關節(jié)腔內(nèi)。4周后處死所有大鼠,取大鼠的關節(jié)軟骨,對軟骨情況進行大體的觀察,應用qRT-PCR檢測miR-411在關節(jié)軟骨組織中的表達情況,利用Western Blot對關節(jié)軟骨中的MMP-13、Ⅱ型膠原和Ⅳ型膠原的表達水平進行檢測。結果:1.在SD大鼠OA模型中,手術組4周后的脛骨平臺關節(jié)軟骨表面尚平滑,略粗糙,失去正常光澤,顏色較正常顏色略黃,局部軟化。假手術組軟骨則無明顯退行性改變。2.通過qRT-PCR檢測不同分組中軟骨組織的miR-411表達情況,發(fā)現(xiàn)在假手術組及LV陰性對照組中的表達水平尚無明顯改變。而在過表達組中,miR-411的表達水平顯著上調(diào)(P0.05),低表達組中miR-411的表達水平顯著下調(diào)(P0.05)。3.通過Western Blot檢測造模后的MMP-13、Ⅱ型膠原和Ⅳ型膠原的表達情況,發(fā)現(xiàn)在在手術組中MMP-13的表達較假手術組升高,而II型膠原和IV型膠原的表達降低;在miR-411過表達組中則發(fā)現(xiàn)MMP-13的表達水平降低,而II型和IV型膠原的表達略增加;而miR-411低表達組則情況相反,MMP-13的表達增加,而II型和IV型膠原的表達降低。發(fā)現(xiàn)miR-411隨著關節(jié)軟骨退行的程度加深而表達水平呈下降趨勢,而MMP-13的表達則隨著關節(jié)軟骨退行的程度加深而表達水平呈上升趨勢,II型膠原和IV型膠原的表達則與miR-411表達趨勢相似。結論:1.驗證了通過采用前交叉韌帶橫斷加內(nèi)側半月板切除的方法可以構建SD大鼠OA模型,該手術方法操作簡單,創(chuàng)傷較小,可重復性高,適合骨性關節(jié)炎動物模型的建立。2.miR-411在SD大鼠OA模型軟骨組織中呈低表達,而MMP-13在軟骨組織中呈高表達,兩者呈現(xiàn)顯著的負相關關系,共同作用于骨性關節(jié)炎軟骨組織的退變過程中。本研究通過關節(jié)腔內(nèi)注射慢病毒構建miR-411異常表達的模型,發(fā)現(xiàn)miR-411的表達水平同OA發(fā)展的嚴重程度密切相關,當miR-411過表達時可以通過靶向抑制MMP-13的表達來延緩OA進程中軟骨退變程度,在OA的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色,為OA發(fā)病機制的探索及OA新型靶向治療提供了新思路。
【學位單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R684.3;R-332
【部分圖文】：

取仰臥位，術者帶手術帽、口罩，洗手消毒后戴無菌手套，對大鼠右下巾，首先觸及右膝關節(jié)髕骨位置，在其內(nèi)側 1cm 左右位置行縱行切口，長約 切開剝離，直至暴露膝關節(jié)腔，然后假手術組逐層縫合各層組織，不破壞任手術組將髕骨向外側脫位，然后屈曲膝關節(jié)，將前交叉韌帶及內(nèi)側半月板充術中注意保護內(nèi)側副韌帶，然后直視下將前交叉韌帶完全橫斷，注意避免術帶發(fā)生增生黏連，隨后使用眼科剪將內(nèi)側半月板切除，最后將髕骨復位后，水及碘伏沖洗關節(jié)腔，使用 5-0 縫線完整關閉關節(jié)腔，逐層縫合切口，刀口大鼠清醒后回籠飼養(yǎng)，自由活動，不固定術側下肢。術后前三天給與注射青感染，每 3 天更換一次墊料，每天觀察大鼠生命狀態(tài)，確保右下肢可正�；顒覱A 模型手術后的第 7 天和第 14 天將 100uL 慢病毒介導的 miR-411 m*108TU / ml）、100uL 慢病毒介導的 miR-411inhibitor（2*108TU / ml）注射到的大鼠膝關節(jié)腔內(nèi)，將 100uL 慢病毒介導的 miR-411 LV 陰性對照（5*108TU 到假手術組大鼠膝關節(jié)腔內(nèi)，4 周后處死所有組別的大鼠并收集膝關節(jié)標本的脛骨平臺、股骨內(nèi)外側髁及髕股關節(jié)處的軟骨及軟骨下骨，放置于液氮中保

結果結果1 大鼠脛骨平臺關節(jié)面大體觀察各組小鼠均存活至實驗完成，未發(fā)生感染、死亡等情況，動物模型制備完成后手術組組大鼠右膝關節(jié)活動受限明顯，假手術組未見明顯異常。手術組 4 周后可見膝脛骨平臺關節(jié)軟骨表面尚平滑，略粗糙，失去正常光澤，透明度下降，顏色較正顏色略黃，局部軟化。假手術組軟骨則無明顯退行性改變。

手術組 miR-411 mimics miR-411 inhibitor 假手術組圖 3 Western Blot 檢測 MMP-13、II 型膠原和 IV 型膠原的表達RT-PCR 結果通過 qRT-PCR 檢測不同分組中軟骨組織的 miR-411 表達情況，發(fā)現(xiàn)在所有 OA軟骨中均有 miR-411 表達，其中在假手術組及 LV 陰性對照組中 miR-411 的表達尚無明顯改變。而在過表達組中，miR-411 的表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05），低組中 miR-411 的表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。
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本文編號：2876115