大腦內復雜的神經網絡是由龐大數(shù)量的神經元通過突觸連接形成的。神經元之間信息的傳遞與處理,是大腦認知和記憶的功能基礎�；铙w成像技術,結合功能標記來記錄神經元動態(tài)活動,已經成為了腦功能研究的主要方法之一。而顱窗方法,解決了顱骨不透明等問題,為直接觀察皮層神經活動提供了技術支撐。但是,顱窗方法還存在著固定不穩(wěn)和顱窗不密閉等問題,這些問題阻礙了對清醒動物成像的研究。具體的說,第一,小鼠頭部固定問題。實驗中人們通常使用固定桿或固定片固定小鼠頭部,但顱骨表面剩余的軟組織會導致固定裝置與軟組織的接觸面不穩(wěn)。當清醒小鼠活動時,這種不穩(wěn)定性會造成固定裝置機械穩(wěn)定性降低。同時,頭部固定機械結構的穩(wěn)定性不足也會引發(fā)成像環(huán)節(jié)的焦平面晃動,甚至機械結構脫落。第二,顱窗的密閉問題。顱窗手術中,常用膠水黏合的方法來封閉玻璃片和顱骨之間的縫隙,這種方法因顱窗密閉性不強,而導致膠水進入顱腔內部和引發(fā)腦部炎癥等現(xiàn)象,這不僅破壞了顱窗內的生理環(huán)境,而且會遮擋甚至覆蓋目標區(qū)域。這些問題影響了清醒小鼠的功能成像效果,導致了長時觀測的穩(wěn)定性差和成功率低。針對上述問題,本文建立了一種用于清醒小鼠雙光子成像的顱窗方法。通過改進固定方式提升了固定裝置機械穩(wěn)定性,優(yōu)化手術步驟增強了顱窗的密閉性并減少了炎癥的發(fā)生,從而成功的實現(xiàn)了清醒小鼠皮層神經元功能信號的長時穩(wěn)定觀察。首先,通過新型的頭部固定裝置并基于該固定裝置的機械結構處理顱骨表面大量存在的軟組織,將固定裝置和已清除軟組織的剛性顱骨牢固地連接在一起,保證了長時間的高機械穩(wěn)定性。其次,通過使用顱窗玻璃和鈦環(huán)的組合部件避免膠水與玻璃的直接接觸;根據(jù)顱窗玻璃的尺寸大小制作顱窗模具,精準把握顱窗尺寸;在顱窗玻璃安裝過程中使用加工制作的固定支架對顱窗玻璃進行定位和壓緊,實現(xiàn)了顱窗玻璃與顱骨的高密閉性,從而避免了膠水進入顱腔和炎癥的發(fā)生。最終實現(xiàn)了對清醒小鼠腦部的長時程功能成像。使用上述頭部固定和顱窗手術的優(yōu)化方法,我們實施了不同品系的轉基因小鼠的顱窗手術,并對術后14天的小鼠皮層神經元進行了活體成像。對清醒狀態(tài)小鼠,清晰地觀察到位于皮層350μm深度的神經元胞體和樹突結構,這證實了該方法具有較好的機械穩(wěn)定性和顱窗透光性。同時,我們還將該方案運用到了神經元功能研究中。以小鼠運動視覺為模型,在術后10天和57天分別對神經元胞體進行觀測,并且當給予視覺刺激時,可穩(wěn)定記錄到鈣響應信號。本文完善了顱窗手術方法,建立了完整的顱窗手術方案,并基于該方案可對神經元功能信號的長時程記錄。本方法的建立,提供了一種完善的顱窗手術方案,解決了成像過程中清醒小鼠的抖動和顱窗內部炎癥組織對信號的遮擋問題,提高了清醒小鼠神經元成像的成功率,為神經活動的長時穩(wěn)定記錄提供了技術支撐,對于探索神經環(huán)路功能,進而理解大腦復雜行為背后的神經機制有重大意義。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TP391.41;R-332
【部分圖文】：

鈣離子探針具有廣泛的應用前景。基因型鈣離子探針又根據(jù)發(fā)光原理可分為由共振能量轉移的熒光蛋白對構成的鈣離子探針[16-20]和單個熒光蛋白為基礎的鈣指示劑，如 GCaMP 鈣離子探針。本文主要對 GCaMP 鈣探針進行論述。1) GCaMP 探針的結構和研發(fā)GCaMP 鈣探針主要包括綠色熒光蛋白(GFP)、鈣調蛋白(CaM)和平滑肌細胞肌白輕鏈激酶片段 M13，如圖 1-1 所示。其中綠色熒光蛋白的環(huán)狀序列發(fā)生改變增強型綠色熒光蛋白（cpEGFP）。在神經元間進行信號傳導的過程中，細胞內離子會發(fā)生變化，當鈣離子含量上升，其與鈣調蛋白(CaM)結合后會發(fā)生構象改而環(huán)繞在 M13 片段周圍，三者相互作用引起綠色熒光蛋白周圍的生色環(huán)境發(fā)生，從而使 GCaMP 的熒光發(fā)生改變，熒光強度的變化可以間接反映出神經元的活弱[21]。但是其也存在靈敏度低和動力學緩慢的問題[22]。在這些基礎上，后來的工作者對 GCaMP 進行了一系列的改造與升級。

圖 1-2 雙光子激發(fā)熒光的原理，摘自文獻[56]。Figure 1-2 Principle of two-photon excited fluorescence.顯微成像技術顯微成像技術是指將顯微鏡集成小型化之后固定到小鼠頭上鼠神經元進行實時成像。最初的單光子微型顯微鏡設計較為成像過程中可以研究自由狀態(tài)下小鼠胡須對外界刺激的響應成像無法對深層次腦組織中神經元細胞活動進行有效的記錄的缺點，因此單光子微型顯微鏡的應用存在著一定的局限性型顯微鏡日益受到人們的矚目，雙光子成像技術已發(fā)展應用mchen 等[63]在 2001 年設計出雙光子微型顯微鏡，但其時間分，會阻礙小鼠的活動，未受到廣泛的使用。Engelbrecht 等[64]微型顯微鏡，重量輕，但仍未完成對自由活動狀態(tài)下大鼠皮

圖 1-3 雙光子微型顯微鏡實物圖，摘自文獻[65]。Figure 1-3 Physical drawings of a two-photon micro-microsco系統(tǒng)具有穩(wěn)定和易操作的優(yōu)點，可用于獎罰等神經環(huán)路的研技術可以克服焦躁等相關的癥狀[66, 67]，且具有較高的空織表層神經元胞體的鈣離子信號，也可以通過在深度腦部位的深部腦區(qū)鈣信號探測[68, 69]。實現(xiàn)對特定區(qū)域神經復雜功能方面具有重要作用。著光遺傳學技術的發(fā)展，與之結合的光纖記錄成像技術路的功能研究中。光遺傳學技術是在目標腦區(qū)實現(xiàn)光敏大腦組織內，通過特定激光對目標腦區(qū)的照射，激活或而研究與行為相關的神經環(huán)路活動。如 2016 年 Zhou 等
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本文編號：2874749