真核細胞通過選擇性自噬的方式識別胞內(nèi)細菌的過程稱為細菌自噬。細菌自噬在宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用。在細菌自噬研究中最核心的問題即宿主細胞是如何感知胞內(nèi)細菌并啟動自噬的。雖然許多課題組對此進行過大量研究并提出很多宿主自噬系統(tǒng)主動識別胞內(nèi)細菌的假說,但現(xiàn)有的模型均不能解釋所有現(xiàn)象。在本論文中,我們從沙門氏菌感染細胞后只能引起少量自噬體形成這一表型出發(fā),首次利用細菌全基因組轉(zhuǎn)座子篩選鑒定出一個可以高效抑制細菌自噬的新型效應蛋白(命名為SebX)。沙門氏菌的sebX缺失突變體可以使宿主通過自噬識別細菌的比例增加到80%,這解釋了為什么只有少部分野生型沙門氏菌能夠被宿主自噬反應識別。我們進一步發(fā)現(xiàn),SebX可以抑制不同種類細菌觸發(fā)的自噬過程,但對包括經(jīng)典自噬在內(nèi)的其它自噬通路沒有影響。SebX對細菌自噬的選擇性表明細菌自噬的發(fā)生機制與經(jīng)典自噬通路不同。接下來,為了研究細菌自噬所必需的宿主基因,我們設計并完成了基于流式細胞熒光分選的CRISPR/Cas9全基因組篩選。篩選發(fā)現(xiàn)除已知的ATG基因外,V-ATPase復合物也參與在細菌自噬過程中。一系列實驗證明只有在細菌感染的條件下,V-ATPase可以與ATG16L1結(jié)合,并介導細菌自噬的起始。V-ATPase與ATG16L1的相互作用依賴于ATG16L1的WD40結(jié)構(gòu)域,并且二者的結(jié)合可以被SebX破壞。我們還證明SebX可以通過抑制V-ATPase-ATG16L1通路進而促進沙門氏菌在體內(nèi)的擴散與增殖。通過解析SebX的晶體結(jié)構(gòu),我們發(fā)現(xiàn)SebX具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性(與霍亂毒素相似,它被真核蛋白ARF家族蛋白激活)。在富集修飾底物并對其進行質(zhì)譜分析后,我們發(fā)現(xiàn)ATP6V0C(V-ATPase復合物的亞基)為SebX的底物蛋白。細菌感染分泌的SebX催化ATP6V0C第124位谷氨酰胺發(fā)生ADP-核糖基化修飾,進而抑制細菌自噬的發(fā)生。最后,我們證明ATP6V0C第124位氨基酸決定了細菌自噬是否可以發(fā)生,但不影響經(jīng)典自噬途徑。本研究從細菌和宿主細胞兩方面出發(fā),最終同時指向V-ATPase復合物與ATG16L1的結(jié)合決定了細菌自噬的發(fā)生這一結(jié)論。效應蛋白SebX的發(fā)現(xiàn)為了解細菌自噬的識別機制提供了關(guān)鍵的證據(jù)。V-ATPase-ATG16Ll介導細菌自噬的發(fā)現(xiàn)解答了長期以來關(guān)于細菌自噬識別的疑問,為細菌自噬的調(diào)控機制提供了新的實驗證據(jù)。
【學位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S852.61;R378.22
【部分圖文】：

粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）。??細胞自嗤的概念最早在１９６３年由Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ?ｄｅ?Ｄｕｖｅ提出（Ｄｅ?Ｄｕｖｅ?ｅｔ?ａｌ．，１９６３），??即將細胞質(zhì)物質(zhì)運送到自身溶酶體（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）進行降解的過程（圖１．１）。細胞自噬??最大的特點是形成一個將待降解的細胞質(zhì)物質(zhì)包裹起來的雙層膜泡結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)??稱之為自嗤體（ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ）。長期以來，人們對于自暖過程的研究僅限于通過電??子顯微鏡觀察的形態(tài)學研宄。直到１９９２年，ＹｏｓｈｉｎｏｒｉＯｈｓｕｍｉ在釀酒酵母??ｃｅｒｅｖｉｓｉｆｌｅ）中巧妙地建立起一個可快速簡便觀察自嗤形成的模型??（Ｔａｋｅｓｈｉｇｅｅｔａｌ．，１９９２），才為細胞自噬分子生物學時代的開啟奠定基礎。釀酒酵母細??胞中的液泡（ｖａｃｕｏｌｅ）相當于哺乳動物細胞中的溶酶體，含有多種蛋白酶，負責生物??大分子的降解。并且酵母的液泡結(jié)構(gòu)非常大（直徑約３?ｊｘｍ），在光學顯微鏡下就可清??晰觀察其形態(tài)。在饑餓條件下，蛋白酶缺失突變體的釀酒酵母液泡中出現(xiàn)了大量球狀??囊泡狀結(jié)構(gòu)

粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）。??細胞自嗤的概念最早在１９６３年由Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ?ｄｅ?Ｄｕｖｅ提出（Ｄｅ?Ｄｕｖｅ?ｅｔ?ａｌ．，１９６３），??即將細胞質(zhì)物質(zhì)運送到自身溶酶體（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）進行降解的過程（圖１．１）。細胞自噬??最大的特點是形成一個將待降解的細胞質(zhì)物質(zhì)包裹起來的雙層膜泡結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)??稱之為自嗤體（ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ）。長期以來，人們對于自暖過程的研究僅限于通過電??子顯微鏡觀察的形態(tài)學研宄。直到１９９２年，ＹｏｓｈｉｎｏｒｉＯｈｓｕｍｉ在釀酒酵母??ｃｅｒｅｖｉｓｉｆｌｅ）中巧妙地建立起一個可快速簡便觀察自嗤形成的模型??（Ｔａｋｅｓｈｉｇｅｅｔａｌ．，１９９２），才為細胞自噬分子生物學時代的開啟奠定基礎。釀酒酵母細??胞中的液泡（ｖａｃｕｏｌｅ）相當于哺乳動物細胞中的溶酶體，含有多種蛋白酶，負責生物??大分子的降解。并且酵母的液泡結(jié)構(gòu)非常大（直徑約３?ｊｘｍ），在光學顯微鏡下就可清??晰觀察其形態(tài)。在饑餓條件下，蛋白酶缺失突變體的釀酒酵母液泡中出現(xiàn)了大量球狀??囊泡狀結(jié)構(gòu)

?Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ?Ａｕｔｏｌｙｓｏｓｏｍｅ??圖１．１細胞自噬通路示意圖（Ｃｈｏｉ?ｅｔａｌ．，２０１３）??自噬通路可以分為起始（形成雙層的隔離膜）、囊泡延伸并包裹細胞質(zhì)組分、自噬體成熟（雙層膜??封閉）、自噬溶酶體形成（與溶酶體融合）和內(nèi)容物降解幾個階段。??表１．１酵母Ａｔｇ蛋白在哺乳動物細胞中對應的同源蛋白（Ｋｕｂａｌｌａ?ｅｔ?ａＬ，?２０１２）??Ａｔｇｌ?ＵＬＫ１／２?形成ＵＬＫ復合物，參與自噬體的起始??Ａｔｇ２?Ａｔｇ２Ａ／Ｂ?Ａｔｇｌ?８相互作用蛋白??Ａｔｇ３?Ａｔｇ３?類Ｅ２酶，參與Ａｔｇ８與ＰＥ的共價結(jié)合??Ａｔｇ４?Ａｔｇ４Ａ－Ｄ?半胱氨酸蛋白酶，切割并激活Ａｔｇ８??Ａｔｇ５?Ａｔｇ５?參與自噬體的形成與延伸??Ａｔｇ６?Ｂｅｃｌｉｎ?１?參與自嗤體的形成，與Ｖｐｓ３４形成復合物??Ａｔｇ７?Ａｔｇ７?類Ｅｌ酶，參與Ａｔｇ８與ＰＥ、Ａｔｇｌ２與Ａｔｇ５的共價結(jié)合??Ａｔｇ８?ＬＣ３Ａ／Ｂ／Ｃ；?類泛素蛋白，自噬激活時與ＰＥ形成共價連接，插入自噬??ＧＡＢＡＲＡＰ；?體膜上
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本文編號：2869813