背景:現(xiàn)有方法將外源分子如DNA導(dǎo)入到人胚胎干細(xì)胞用于科學(xué)研究的效率普遍較低,如何優(yōu)化現(xiàn)有條件,提高轉(zhuǎn)染效率顯得尤為重要。目的:比較兩種不同的傳代方法對人胚胎干細(xì)胞系H9轉(zhuǎn)染效率的影響,優(yōu)化胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件。方法:人胚胎干細(xì)胞系H9分別采用小克隆傳代法和單細(xì)胞傳代法進(jìn)行傳代,傳代后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48h,用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染p AdTrack-AKT1熒光質(zhì)粒2 d后,熒光顯微鏡下觀察熒光質(zhì)粒的表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測人胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率;RT-qPCR和Westernblot分別檢測轉(zhuǎn)染后AKT1在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。結(jié)果與結(jié)論:①熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞傳代組表達(dá)熒光質(zhì)粒的細(xì)胞數(shù)量更多,流式細(xì)胞儀檢測單細(xì)胞傳代法的轉(zhuǎn)染效率[(47.18±2.00)%]高于小克隆傳代法的轉(zhuǎn)染效率[(19.52±0.86)%],差異有顯著性意義(P0.01);②單細(xì)胞傳代組轉(zhuǎn)染后AKT1 mRNA和蛋白的表達(dá)均高于小克隆傳代組,差異有顯著性意義(P 0.01);③結(jié)果表明,采用單細(xì)胞傳代法,增加細(xì)胞與轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體的接觸面積可提高人胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。
【部分圖文】：

妝澩鎪?劍?峁?礱韉ハ赴???ń檔拖?胞匯合度和細(xì)胞間的緊密程度可明顯提高人胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；同時也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度過小，脂質(zhì)體毒性作用明顯，細(xì)胞死亡增多，轉(zhuǎn)染效率亦不高。因此，轉(zhuǎn)染前優(yōu)化圖注：圖中A-C分別為培養(yǎng)第1，3，7天時的細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)7d時細(xì)胞匯合度可達(dá)80%-90%圖1無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞形態(tài)(×100)Figure1Cellmorphologyofhumanembryonicstemcellsonfeeder-freeplates(×100)圖注：通過細(xì)胞免疫熒光檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人胚胎干細(xì)胞均表達(dá)其特異性標(biāo)志物SOX2和OCT4圖2人胚胎干細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)(×100)Figure2Expressionofspecificmolecularmarkersofhumanembryonicstemcells(×100)圖注：圖中A-C為小克隆傳代，其中A為轉(zhuǎn)染前明場下細(xì)胞形態(tài)，B為轉(zhuǎn)染2d后明場下細(xì)胞形態(tài)，C為B圖對應(yīng)的熒光圖；D-F為單細(xì)胞傳代，其中D為轉(zhuǎn)染前明場下細(xì)胞形態(tài)，E為轉(zhuǎn)染2d后明場下細(xì)胞形態(tài)，F(xiàn)為E圖對應(yīng)的熒光圖圖3兩種不同方法傳代后的人胚胎干細(xì)胞形態(tài)及轉(zhuǎn)染pAdTrack-AKT1熒光質(zhì)粒后的綠色熒光蛋白表達(dá)(×100)Figure3HumanembryonicstemcellswithtwopassagemethodsandexpressionofgreenfluorescentproteinafterpAdTrack-AKT1transfection(×100)小克隆傳代單細(xì)胞傳代100806040200轉(zhuǎn)染效率(%)P<0.01小克隆傳代單細(xì)胞傳代小克隆傳代單細(xì)胞傳代小克隆傳代單細(xì)胞傳代3210P<0.01P<0.01AKT1蛋白表達(dá)水平AKT1mRAN表達(dá)水平543210AKT1GAPDH圖注：圖中A為小克隆傳代流式檢測代表圖；B為單細(xì)胞傳代流式檢測代表圖；C為兩組人?
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