胞內(nèi)菌能在宿主細(xì)胞內(nèi)存活和繁殖,并通過(guò)宿主細(xì)胞的遷移導(dǎo)致胞內(nèi)菌感染的擴(kuò)散。結(jié)核分枝桿菌、傷寒沙門(mén)菌、志賀菌和李斯特菌等均屬于胞內(nèi)菌[1,2]。這些細(xì)菌對(duì)于人類健康造成很大的危害。每年約有上千萬(wàn)人感染胞內(nèi)菌,其中有超過(guò)兩百萬(wàn)人死于胞內(nèi)菌感染疾病。已有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)某些胞內(nèi)菌感染時(shí)能夠?qū)е滤拗骷?xì)胞內(nèi)Rab蛋白表達(dá)的變化,Rab蛋白控制著胞內(nèi)吞噬體的成熟過(guò)程[3]。如結(jié)核分枝桿菌感染后細(xì)胞內(nèi)Rab10、Rab20和Rab32均上調(diào)[4,5]。而且Rab蛋白在自噬體形成過(guò)程中也有重要的調(diào)控作用[6]。目前已證實(shí)Rab32在傷寒沙門(mén)菌和麻風(fēng)分枝桿菌感染中具有重要作用[7,8]。我們的前期結(jié)果證實(shí),DC2.4細(xì)胞中Rab32缺失時(shí),李斯特菌感染后細(xì)胞載菌量較對(duì)照組明顯增加。李斯特菌是一種典型的胞內(nèi)菌,能夠侵入吞噬細(xì)胞和非吞噬細(xì)胞[9,10]。宿主細(xì)胞能夠識(shí)別病原體,吞噬細(xì)菌形成吞噬體,最后形成吞噬溶酶體降解細(xì)菌[11,12]。當(dāng)吞噬體內(nèi)pH值下降時(shí)李斯特菌分泌李斯特菌溶血素(listeriolysin O,LLO),破壞吞噬體膜導(dǎo)致李斯特菌進(jìn)入胞漿[13],胞漿內(nèi)的李斯特菌和含菌囊泡被分離膜包裹形成自噬體來(lái)降解細(xì)菌。已有文獻(xiàn)報(bào)道李斯特菌分泌的ActA蛋白能幫助細(xì)菌逃避自噬[14]。為了闡明Rab32在樹(shù)突狀細(xì)胞影響李斯特菌感染的作用和機(jī)制,我們構(gòu)建了樹(shù)突狀細(xì)胞條件敲除Rab32基因的小鼠、慢病毒轉(zhuǎn)染Rab32基因或LC3基因的細(xì)胞,以及RNA干擾Atg5基因的細(xì)胞,通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞載菌量實(shí)驗(yàn),激光共聚焦顯微鏡技術(shù)和高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng),系統(tǒng)地研究了Rab32在樹(shù)突狀細(xì)胞感染李斯特菌中的作用。本研究的主要內(nèi)容如下:1、通過(guò)基因敲除技術(shù)構(gòu)建樹(shù)突狀細(xì)胞條件敲除Rab32基因的小鼠,我們能夠觀察樹(shù)突狀細(xì)胞中Rab32對(duì)于李斯特菌感染的影響。結(jié)果顯示樹(shù)突狀細(xì)胞條件敲除Rab32基因小鼠生長(zhǎng)發(fā)育未見(jiàn)異常。而且流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明小鼠脾臟和外周淋巴結(jié)中樹(shù)突狀細(xì)胞的數(shù)量和表型未有明顯變化。通過(guò)尾靜脈注射制備李斯特菌系統(tǒng)感染模型,我們能夠觀察樹(shù)突狀細(xì)胞中Rab32對(duì)于李斯特菌增殖的影響。組織載菌量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)李斯特菌感染3天后,樹(shù)突狀細(xì)胞條件敲除Rab32基因小鼠脾臟和肝臟組織細(xì)菌增殖明顯上升。實(shí)驗(yàn)證實(shí)Rab32影響了李斯特菌在小鼠組織中的增殖。2、通過(guò)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞(Bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)進(jìn)行細(xì)胞載菌量實(shí)驗(yàn),我們能夠明確Rab32對(duì)于李斯特菌在樹(shù)突狀細(xì)胞中增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)李斯特菌感染后,Rab32缺失BMDC載菌量明顯上升,以5h時(shí)為甚。為了明確樹(shù)突狀細(xì)胞內(nèi)Rab32與李斯特菌的相互作用,我們構(gòu)建了EYFP-Rab32過(guò)表達(dá)的DC2.4細(xì)胞,通過(guò)高內(nèi)涵圖像分析系統(tǒng)分析RFP表達(dá)李斯特菌感染的細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Rab32囊泡能夠包裹細(xì)菌,且李斯特菌逃逸后Rab32仍能包裹細(xì)菌。接著,通過(guò)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs)和腹膜巨噬細(xì)胞(peritoneal macrophages)的細(xì)胞載菌量實(shí)驗(yàn),以及過(guò)表達(dá)EYFP-Rab32的RAW264.7細(xì)胞的影像學(xué)實(shí)驗(yàn),我們進(jìn)一步明確Rab32抗菌作用在吞噬細(xì)胞中普遍存在。3、為了研究Rab32囊泡在李斯特菌感染的哪些階段發(fā)揮作用,我們利用△hly李斯特菌不能從吞噬體中逃逸的特性和△act A李斯特菌不能遷移的特性,通過(guò)BMDC細(xì)胞載菌量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rab32缺失導(dǎo)致兩種細(xì)菌增殖明顯上升,Rab32在李斯特菌感染的多個(gè)階段發(fā)揮抑菌作用。為了直觀地監(jiān)測(cè)Rab32囊泡在李斯特菌感染過(guò)程中的作用,我們采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)影像觀察,發(fā)現(xiàn)無(wú)論細(xì)菌是否逃逸,Rab32囊泡均能包裹細(xì)菌,且Rab32囊泡內(nèi)的細(xì)菌不能增殖。為了了解Rab32囊泡與自噬之間的關(guān)系,我們采用RNA干擾Atg5基因和高內(nèi)涵圖像分析技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Atg5缺失細(xì)胞內(nèi)Rab32囊泡數(shù)量并未發(fā)生明顯變化。為了進(jìn)一步了解自噬對(duì)于Rab32囊泡功能的影響,我們進(jìn)行了細(xì)胞載菌量實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示干擾Atg5基因后,Rab32缺失BMDC中李斯特菌增殖明顯更多。高內(nèi)涵圖像分析結(jié)果顯示雖然Rab32囊泡與LC3存在共定位,但數(shù)量很少;而且Rab32與LC3雙陽(yáng)性囊泡的變化趨勢(shì)與Rab32囊泡不同,感染2h的細(xì)胞內(nèi)Rab32囊泡最少,而雙陽(yáng)性囊泡最多。結(jié)果表明Rab32囊泡并不完全依賴于自噬發(fā)揮作用。結(jié)論本研究首次發(fā)現(xiàn)了Rab32具有限制李斯特菌增殖的作用,且Rab32作用并不僅僅存在于樹(shù)突狀細(xì)胞,而是吞噬細(xì)胞中普遍存在的機(jī)制。Rab32在李斯特菌感染的多個(gè)階段,甚至在李斯特菌逃逸后仍能發(fā)揮抑菌作用。Rab32通過(guò)形成囊泡參與了吞噬細(xì)胞內(nèi)抑制李斯特菌增殖的作用。綜上所述,Rab32是一種存在于吞噬細(xì)胞的,不依賴于自噬的,新穎的膜性抗菌機(jī)制。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2016
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖 2.1 樹(shù)突狀細(xì)胞條件敲除 Rab32 基因小鼠的構(gòu)建和鑒定 Flp+CD11c+Rab32f/f小鼠構(gòu)建策略圖；B. Flp+CD11c+Rab32f/f小鼠鑒定結(jié)果圖。圖中顯示：646427 和 6429 均為 Flp+CD11c+Rab32f/f小鼠。Figure 2.1 Construction and identification of mice with Rab32 gene knockout in dendritic cel++f/f++f/f

圖 2.2 樹(shù)突狀細(xì)胞條件敲除 Rab32 基因小鼠組織中樹(shù)突狀細(xì)胞表型分析re 2.2 Phenotype analyses of dendritic cells in mice with the Rab32 gene knockout in dendritiby flow cytometry.2.2.3 李斯特菌菌量-OD600值曲線

圖 2.3 李斯特菌感染樹(shù)突狀細(xì)胞條件敲除 Rab32 基因小鼠載菌量實(shí)驗(yàn)斯特菌 OD600 值與活菌數(shù)量之間的線性關(guān)系；B．樹(shù)突狀細(xì)胞條件敲除 Rab32 基因小臟和肝臟中李斯特菌載量變化。igure 2.3: Bacterial load in the liver and spleen of mice with the Rab32 gene knockout in d
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8 陳敏,王穎,顧其芳,李潔;食品中李斯特菌快速檢測(cè)方法的建立與研究[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2001年03期

9 李干紅,丁曉雯;李斯特菌及其快速檢測(cè)[J];廣州食品工業(yè)科技;2002年03期

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本文編號(hào)：2866814