發(fā)布時間：2020-10-26 17:50

　　 一、研究背景與目的鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)是一種重要的醫(yī)院院內(nèi)感染病原菌,是引起醫(yī)院獲得性肺炎,尤其是呼吸機相關性肺炎的重要病原菌,也經(jīng)常引起尿路感染、創(chuàng)傷感染、腦膜炎、腹膜炎、心內(nèi)膜炎、關節(jié)炎癥等感染類型,鮑曼不動桿菌可以進入血流,引起菌血癥,并有可能進一步發(fā)展為敗血癥[1]。鮑曼不動桿菌耐藥問題日趨嚴重,臨床分離株中發(fā)現(xiàn)其耐藥往往是多種耐藥機制的共同作用的結(jié)果。藥物外排泵機制是鮑曼不動桿菌重要的耐藥機制,迄今為止已發(fā)現(xiàn)20余種外排泵,可以大致分為5大外排泵家族,其中最重要的為RND外排泵家族。鮑曼不動桿菌臨床分離株具有能夠從環(huán)境中獲取耐藥基因的能力,對碳青霉烯類抗生素的耐藥機制往往多種耐藥機制共同起作用,多種機制混雜在一起,從而造成藥物泵出外排機制對細菌耐藥的獨立貢獻難以評估,而且由單獨由外排泵機制所產(chǎn)生的耐藥限度的研究也比較少。我們希望通過體外誘導選擇的方式獲得外排泵機制的誘導耐藥菌株,從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平兩種維度去研究包含鮑曼不動桿菌多種外排泵與外膜蛋白基因的系統(tǒng)影響碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制。二、研究方法和結(jié)果研究方法:首先,我們選擇了一株亞胺培南敏感的多重耐藥鮑曼不動桿菌(SZE株),通過添加亞胺培南的選擇壓力下,連續(xù)58代次傳代誘導選擇的方法,獲得了 SZE株的亞胺培南誘導株,監(jiān)測誘導的過程中菌株在去除和添加外排泵抑制劑CCCP的藥敏變化;其次,通過反轉(zhuǎn)錄定量PCR的方法,比較了 SZE株(G1)和其誘導株(G45)藥物外排泵以及外膜蛋白在轉(zhuǎn)錄水平表達量變化情況,初步研究了造成誘導過程中亞胺培南耐藥的外排泵和外膜蛋白的耐藥機制;最后,通過iTRAQ同位素標記結(jié)合LC/MS技術(shù),將鮑曼不動桿菌SZE株(G1)和其誘導株(G45)的蛋白質(zhì)進行分別標記,利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)進行各種外排泵和外膜蛋白在蛋白質(zhì)水平上的鑒定和定量比較,分析了 SZE株在持續(xù)的亞胺培南誘導下,多種外排泵和外膜蛋白在亞胺培南耐藥機制中的作用。研究結(jié)果:1.近年來鮑曼不動桿菌臨床分離株對妥布霉素、亞胺培南、頭孢曲松抗菌藥物的耐藥性上升超過10%。在深圳市某三甲醫(yī)院所分離的1167株臨床株中,與2012-2013年度相比,2014-2015年度鮑曼不動桿菌的臨床分離株對妥布霉素、亞胺培南、頭孢曲松、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等種類抗菌藥物耐藥性均升高10%以上。2.鮑曼不動桿菌臨床株中不同亞胺培南耐藥水平的鮑曼不動桿菌外排泵基因adeB、adeJ的檢出率的差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。根據(jù)CLSI藥敏標準判斷,臨床分離株中不同亞胺培南耐藥水平的鮑曼不動桿菌外排泵基因adeB、adeJ的檢出率的差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),臨床株中攜帶外排泵adeB、adeJ基因與亞胺培南耐藥正相關。3.鮑曼不動桿菌SZE株在亞胺培南(IPM)58代次的選擇誘導下,最小抑菌濃度(MIC)從開始的0.125μg/ml上升到8μg/ml。通過篩選鮑曼不動桿菌菌株庫,選定一株泌尿道感染來源的菌株并命名為SZE株;對其進行亞胺培南耐藥的58代次的體外誘導選擇中,SZE株對亞胺培南的藥物敏感性逐漸下降,對IPM藥敏平板上IPM抑菌圈直徑從開始的24.5mm逐漸減小到13.8mm,最小抑菌濃度(MIC)從開始的0.125μg/ml上升到8μg/ml,根據(jù)CLSI對K-B法和肉湯稀釋法亞胺培南藥敏的解讀,該菌株藥敏判讀從“敏感”變?yōu)椤爸薪椤薄?.亞胺培南誘導過程中,鮑曼不動桿菌SZE株通過外排泵RND家族外排泵基因adeB,adeG和adeJ表達水平分別上調(diào)了 6.9、4.0和2.1倍,獲得亞胺培南的適應性耐藥性。經(jīng)外排泵抑制試驗,在亞胺培南誘導過程中SZE株所產(chǎn)生的亞胺培南藥物敏感性下降基本上可以被外排泵抑制劑CCCP中和,我們推測該菌株誘導耐藥的機制跟耐藥泵機制相關。鮑曼不動桿菌SZE株經(jīng)過多代的亞胺培南誘導選擇,轉(zhuǎn)錄水平的多種外排泵基因表達量顯著上調(diào),RND家族外排泵基因adeB,adeG和adeJ表達上調(diào)超過2倍以上;外膜蛋白的carO,omp33,ompA,ompW和oprD表達量變化不顯著。其中RND家族外排泵基因adeB,adeG和adeJ分別上調(diào)了 6.9、4.0和2.1倍,MATE家族的abeM上調(diào)1.8倍,MFS家族tetB上調(diào)1.7倍,MATE家族的abeM上調(diào)1.8倍,SMR家族的abeS上調(diào)1.4倍。而MFS家族的craA,amvA變化不顯著。而鮑曼不動桿菌亞胺培南誘導株(G45)外膜蛋白基因carO,omp33,ompA,ompW和oprD表達量變化不顯著。誘導過程中,所攜帶的內(nèi)源性blaOXA-51表達量變化不顯著。5.鮑曼不動桿菌RND外排泵家族AdeABC的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因adeRS系統(tǒng)中,adeR基因序列的第58位易突變位點,該位點由G變?yōu)锳是造成adeB相對表達量上調(diào)6.9的原因。adeRS系統(tǒng)中adeR基因序列的第58位發(fā)生了鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰?G變?yōu)锳),這個突變造成AdeR蛋白質(zhì)序列中第20位的天冬氨酸突變?yōu)樘於０?而這個突變或許是造成adeB相對表達量上調(diào)6.9的原因。6.通過比較蛋白質(zhì)組學研究,篩選了 AdeB等5個外排泵相關蛋白和OmpA等7個膜相關蛋白是潛在的開發(fā)新型抗鮑曼不動桿菌的藥物的靶標蛋白。SZE株經(jīng)過多代的亞胺培南誘導選擇,蛋白質(zhì)水平上外排泵相關蛋白表達量上升 1.5 倍的有 5 個:分別為 AdeAmembranefusionprotein、AdeB、pH adaptation potassium efflux system transmembrane protein、pH adaptation potassium efflux system D transmembrane protein、Putative RND family drug transporter。而RND家族外排泵AdeABC組成蛋白AdeA和AdeB蛋白質(zhì)水平的表達量上升分別為2.45和2.47。亞胺培南誘導株(G45)膜相關蛋白在蛋白質(zhì)水平表達量表達量下降超過2倍的有7個,分別為Putative membrane protein、Putative membrane protein、MFS permease、Outer membrane protein assembly factor BamE、Putative membrane protein、OmpA/MotB、Outer-membrane lipoprotein carrier protein、Outer-membrane lipoprotein LolB。外膜蛋白表達量的下降可能與亞胺培南誘導株(G45)獲得的耐藥機制相關。這些所篩選的蛋白質(zhì)水平上表達量發(fā)生變化的外排泵和外膜蛋白,或許可以作為開發(fā)新型抗菌藥物的潛在的靶標蛋白。通過以上研究,分別在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平分析了 SZE株在持續(xù)的亞胺培南誘導下,多種外排泵和外膜蛋白在亞胺培南耐藥中的作用機制。三、結(jié)論首先,我們研究發(fā)現(xiàn)近年來鮑曼不動桿菌臨床分離株對多種抗菌藥物的耐藥性上升明顯,攜帶外排泵adeB、adeJ基因與亞胺培南耐藥正相關。2012-2015年來鮑曼不動桿菌臨床分離株對多種抗菌藥物的耐藥性上升明顯,特別是妥布霉素、亞胺培南、頭孢曲松、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等種類抗菌藥物耐藥性均升高10%以上。臨床分離株中不同亞胺培南耐藥水平的鮑曼不動桿菌外排泵基因adeB、adeJ的檢出率的差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),臨床株中攜帶外排泵adeB、adeJ基因與亞胺培南耐藥正相關。其二,臨床常用的抗菌藥物亞胺培南(商品名泰能)是一種潛在的鮑曼不動桿菌耐藥誘導劑。鮑曼不動桿菌SZE株經(jīng)亞胺培南(IPM)58代次的選擇誘導下,對碳青霉烯類抗菌藥物的敏感性逐漸下降,最小抑菌濃度(MIC)從開始的0.125μg/ml上升到8μg/ml。再三,外排泵RND家族AdeABC、AdeFGH和AdeIJK的表達上調(diào)是鮑曼不動桿菌SZE株耐藥性增強的重要原因,而外排泵調(diào)節(jié)系統(tǒng)-adeRS系統(tǒng)中重要位點發(fā)生的單核苷酸突變造成AdeABC外排泵的表達水平上升。鮑曼不動桿菌可以通過上調(diào)外排泵的表達水平,特別是RND家族外排泵基因adeB,adeG和adeJ表達水平獲得亞胺培南的耐藥性;鮑曼不動桿菌RND外排泵家族AdeABC的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因adeRS系統(tǒng)中,adeR基因序列的第58位易突變位點,該位點由G變?yōu)锳可能是造成adeB相對表達量上調(diào)6.9的原因;其四,在缺少碳青霉烯酶耐藥機制協(xié)同作用情況下,外排泵機制對鮑曼不動桿菌適應性耐藥的獨立貢獻有限。亞胺培南敏感的多重耐藥鮑曼不動桿菌(SZE株),通過在亞胺培南作用下,連續(xù)58代次傳代誘導選擇的方法,獲得了 SZE株的亞胺培南誘導株最小抑菌濃度(MIC)從開始的0.125μg/ml上升到8μg/ml,但是該菌株在缺少碳青霉烯酶耐藥機制協(xié)同作用情況下,通過上調(diào)外排泵表達水平作用機制,藥敏結(jié)果根據(jù)CLSI標準判讀:經(jīng)過58代誘導,藥敏趨于穩(wěn)定,誘導作用的最大效果是由“敏感”變?yōu)椤爸薪椤?一直都無法進一步變成“耐藥”。最后,通過比較蛋白質(zhì)組學研究,篩選了 AdeB等5個外排泵相關蛋白和OmpA等7個膜相關蛋白可能成為潛在的開發(fā)新型抗鮑曼不動桿菌的藥物的靶標蛋白。綜上所述,本研究中我們從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平兩種維度去研究包含鮑曼不動桿菌多種外排泵與外膜蛋白基因的系統(tǒng)影響碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制,外排泵耐藥機制,特別是RND外排泵家族家族在鮑曼不動桿菌耐藥中發(fā)揮重要作用,為多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDR-AB)的臨床治療和新型抗菌藥物的研制提供理論基礎。
【學位單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R378
【部分圖文】：

成細菌耐藥。細菌外膜屬于半透性膜，對抗生素和其他生物大分子均構(gòu)成屏障，??外膜上存在通道蛋白，又稱為膜孔蛋白（ｐｏｒｉｎｓ），組成親水性通道，通道內(nèi)親水??的小分子物質(zhì)可以自由通過，如圖１－２所示。鮑曼不動桿菌外膜通透性極低，大??約只有大腸埃希菌（￡．ｃｒｏ／Ｄ的１％－３％。近年來發(fā)現(xiàn)細菌減少膜孔蛋白表達從而??有效降低外膜通透性機制也是鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的重要原??因之一，這種細菌外膜異常低通透性造成進入菌體內(nèi)的抗菌藥物的有效濃度降??低，從而導致了抗生素耐藥。??８??

（ｍｕｌｔｉｄｒａｇ?ａｎｄ?ｔｏｘｉｃ?ｃｏｍｐｏｕｎｄ?ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ?ｆａｍｉｌｙ，ＭＡＴＥ）、ＡＴＰ?偶聯(lián)盒超家族??（ＡＴＰ－ｂｉｎｄｉｎｇ?ｃａｓｓｅｔｔｅ?ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ＡＢＣ）、小多藥耐藥家族（ｓｍａｌｌ?ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ??ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｆａｍｉｌｙ，?ＳＭＲ）［３９］（圖１－３）。這五個家族來源的外排栗在鮑曼不動桿菌上??都有發(fā)現(xiàn)，外排泵與鮑曼不動桿菌多重耐藥的關系正逐漸引起人們的高度關注??［４￡）］。Ｗｅｎｓｉｓ?Ｈｕ等研究發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動桿菌臨床分離株培養(yǎng)基中加入泵抑制劑??ＣＣＣＰ后，菌株對亞胺培南的耐藥性明顯下降，ＭＩＣ降低為原菌株的四分之一以??上［４１］。??鮑曼不動桿菌最重要的是ＲＮＤ家族的外排泵。該家族外排泵可以將氨基糖??苷類、頭孢噻辟、四環(huán)素類、氯霉素、甲氧芐氨嘧啶和氟喹諾酮類藥物泵出細??菌細胞外。ＲＮＤ家族的主要成員包括ＡｄｅＡＢＣ、ＡｄｅＦＧＨ和ＡｄｅｌＪＫ。ＡｄｅＡＢＣ??１０??

顯著升高的藥物依次為ＴＺＰ（?１７．０６％）、妥布霉素（１６．１９％）、亞胺培南（１６．６５％）、??頭孢曲松（１６．５２％）、頭孢他啶（１５．４６％）。各抗生素的藥敏結(jié)果見表２－３。??１１６７株鮑曼不動桿菌的耐藥情況如
【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 張輝;張小江;徐英春;楊青;汪復;朱德妹;倪語星;孫景勇;孫自鏞;簡翠;胡云建;艾效曼;張泓;李萬華;賈蓓;黃文祥;王傳清;薛建昌;魏蓮花;吳玲;卓超;蘇丹虹;張朝霞;季萍;徐元宏;沈繼錄;單斌;杜艷;俞云松;林潔;;2011年中國CHINET不動桿菌屬細菌耐藥性監(jiān)測[J];中國感染與化療雜志;2013年05期

相關博士學位論文 前2條

1 王悅;泛耐藥鮑曼不動桿菌臨床株W61耐藥與播散機制的基因組學研究[D];天津醫(yī)科大學;2012年

2 彭敬紅;鮑曼不動桿菌醫(yī)院感染及耐藥機制研究[D];華中科技大學;2009年

相關碩士學位論文 前1條

1 曹志遠;橡膠樹紅根病菌響應己唑醇脅迫的蛋白質(zhì)組學研究[D];海南大學;2017年

本文編號：2857314